一种测定雌三醇含量的免疫分析法制造技术

本发明专利技术为在磁性微粒子表面包被雌三醇抗体，应用于雌三醇免疫分析检测的方法。其技术特征包括：将待测抗原的抗体通过共价键连接在磁性微粒子表面上。包被前充分洗涤磁性微粒子，在指定的缓冲溶液体系中加入磁性微粒子和雌三醇抗体血清，室温震荡条件下进行反应。包被有雌三醇抗体的磁性微粒子封闭后，可直接参与免疫反应，用于雌三醇免疫分析。在抗体包被及分析测定过程中，可以配套使用磁性分离器进行沉淀分离。本发明专利技术操作简便，成本低廉。反应过程一步到位，无需大型贵重仪器即可完成操作，并可与多种型号的检测仪器配合使用，适宜普遍推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术用于标记免疫分析领域，特别适用于标记免疫分析法中的竟争法 原理测定雌三醇含量。
技术介绍
内分泌系统作为人类机体的三大信息传递系统之一 ，在调节机体各项功 能方面起着重要的作用。内分泌系统受到干扰会导致机体整个内环境的稳定 性遭到破坏。激素作为内分泌腺的一种重要的天然产物，在调节机体功能， 维持内环境稳定方面有着不可替代的作用。激素在血液中以低浓度传递，并 与靶细胞受体结合，对机体功能起到的调节作用。激素过少时会引起某些组织或器官功能失调，甚至危及生命；激素过多，则会引起内分泌机能亢进。 雌三醇作为主要的d、分子雌激素之一，是雌二醇在人体内代谢的最终产物。 雌三醇不具有生物活性，但其含量可以反映人体生长发育和生殖系统状况， 准确测定体内的雌三醇含量有着重要的意义。目前，我国M^定的人体雌三醇 正常含量，男性及未孕妇女小于7 nmol/L,妊娠期妇女为104-1215 nmol/L。免疫分析法是以抗原与抗体特异性结合为基础而建立的生物化学方法。 由于抗原与抗体是一对一的专一反应，因此免疫分析法具有高度的选择性。 免疫分析根据标记与否可分为标记免疫分析法和非标记免疫分析法。最成熟 的标记免疫分析法是放射免疫分析法。但由于放射性物质的毒害性，此方法 已经逐渐开始被非^t射免疫分析方法所代替，其中包括酶联免疫分析法、 荧光免疫分析法、电化学分析法、电化学发光分析法和化学发光分析法等。 标记免疫分析中的竟争法又称竟争性抑制法，主要是根据标记抗原与同种未 标记待测抗原与抗体间可发生竟争性结合的原理，主要用于测定小分子抗 原。标本中的抗原和一定量的标记抗原竟争与固相抗体结合。标本中抗原量 越多，结合在固相上的酶标抗原愈少，因此阳性反应检测信号值低于阴性反 应，检测信号值与待测抗原的浓度成反比。竟争法测抗原有多种模式，可将 标本和标记抗原同时加入与固相抗体竟争结合，也可将标本先加入到固相抗 体中进行结合，洗涤后再加入标记抗原，与结合在固相上的抗原竟争进行取代反应。近年来，磁性微粒子的应用使免疫分析技术研究取得了重大进展，灵敏 度得到提高，反应时间大大缩短，为实现全自动化检测提供了有利条件。磁性微粒子直径一般为800-2000nm,其表面带有活性基团，如-C0NH2， -COOH 等，具有包被量大，均一性高，牢固性强等优点，是免疫反应中理想的固相 材料。目前在我国免疫分析领域，磁性微粒子主要作为免疫反应完成后的分 离试剂使用，以缩短分离时间，筒化分离过程。而在国外进口的全自动磁性 微粒子免疫分析仪器中，磁性微粒子可作为抗体包被固相材料直接参与免疫 反应，如拜耳公司生产的ACS全自动化学发光免疫分析系统。相对于传统的 免疫反应模式而言，这种由磁性微粒子直接参与的免疫反应在反应时间、均 一性和稳定性方面都有着传统反应模式不可比拟的优越性。但是这种进口的 仪器价格昂贵且无法与国产仪器配套使用，维护管理复杂， 一旦损坏不易修 理，从而大大限制了其应用。因此， 一种简便、稳定、价格适中、适用性广 泛的，且适用于国产免疫检测仪器的磁性微粒子固相包被技术将在免疫分析 领域有着广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种磁性微粒子作为抗体包被固相材料应用于免 疫分析，特别是竟争法测定雌三醇的方法。该方法将待测抗原的抗体通过共 价键连接在磁性微粒子表面上，由磁性微粒子直接参与免疫反应。磁性微粒 子粒径小，M程度高，大大增加了包被表面积，增大抗原和抗体的结合几 率，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速率加快。配合振荡器及》兹板分离器 使用，无需离心分离，使清洗和分离更加简便。反应一步到位，过程简便， 无需大型贵重仪器即可完成操作，并可与多种型号的检测仪器配合使用。本专利技术的技术方案如下一种用于雌三醇检测的磁性微粒子免疫分析法，其中包括以下步骤1. 将成品磁性微粒子用洗涤液进行充分洗涤，每次洗涤后用磁性分离器 使磁性微粒子充分沉淀，弃去上清液；2. 洗涤后的磁性微粒子用稀释液稀释还原至原体积，加入适量anti-E3 血清室温震荡条件下进行包被，抗体血清可直接加入，不需要经过纯化处理；3. 反应结束后，分离、洗涤，加入封闭液，室温振荡封闭，封闭后的磁 性微粒子用磁性微粒子稀释液稀释还原至原体积，在4 。C条件下可保存一年以上；4.使用包被有anti-E3的磁性微粒子测定雌三醇时，用磁性微粒子稀释 液将其按l: 6的比例进一步稀释后，作为固相抗体直接参与免疫反应。在上述免疫分析法中，洗涤液为生理盐水(含O. 9% NaCl)， 一般洗涤3 次以上，去除原有緩冲液中可能存在的干扰物质。磁性分离器由意大利 Biochem公司提供，磁场强度为4000高斯。最后一次洗涤弃去上清后，加入磁性微粒子稀释液将磁性微粒子还原至 洗涤前原体积。磁性微粒子稀释液成分为25mmol/L PB緩沖液(pH值7. 4 ), 每1000mL含水解明胶2. 5g，牛血清蛋白(BSA) 7. 5g，氯化钠(NaCl) 4. 5g, 防腐剂(Priclin-300 ) 0. 5ml。在磁性微粒子中加入适量anti-E3血清，在平悬振荡器上室温振荡反应 3-4h。 一般anti-E3血清力口入量为每lmL磁性微粒子加入anti-E3血清l ju 1。反应结束后，用磁性分离器将磁性微粒子充分沉淀后吸去上清。用生理 盐水洗涤2次后，加入封闭液，在平悬振荡器上室温振荡封闭2h。封闭液成 分为50mmol/L PB緩冲液(pH值7. 4 ),每1000mL含水解明胶5g，牛血清蛋白 (BSA) 15g,防腐剂(Priclin-300 ) 0. 5ml。封闭后的磁性微粒子用磁性微 粒子稀释液稀释还原至原体积，在4 。C条件下可保存一年以上。使用时，用磁性樣i粒子稀释液将其按一定比例进一步稀释后，作为固相 抗体直接参与免疫反应，稀释比例一般为1:6。附图说明图l为本专利技术的反应原理及操作流程图， (1) 在烧杯中加入洗涤后的磁性微粒子和雌三醇抗体血清。 (2 ) 室温震荡条件下进行反应，抗体包被在磁性微粒子表面。 (3 ) 反应完毕后，用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀后分离洗涤。图2为包被有雌三醇抗体的磁性微粒子应用于雌三醇免疫分析反应原理 及操作流程图。(1)在烧杯中加入包被有雌三醇抗体的磁性微粒子、雌三醇及雌三醇标' 记物。(2 )雌三醇和雌三醇标记物与雌三醇抗体发生竟争性免疫反应。 (3)反应完毕后，用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀后分离洗涤。 图3为本专利技术的磁性微粒子放射免疫分析法与磁性微粒子作为分离试剂的常用放射免疫分析法测定人血清样本相关性曲线；试剂的常用化学发光免疫分析法测定人血'i样本相关性曲线；' 、图5为本专利技术的磁性微粒子化学发光免疫分析法及经典板式化学发光免 疫分析法测定人血清样本相关性曲线。具体实施方式下面结合附图及实施例进一步描述本专利技术。 实施例l本实施例为使用本专利技术的包被有雌三醇抗体的磁性微粒子应用于雌三 醇放射免疫分析法检测。首先，反应前将包被有anti-E3的磁性微粒子用稀释液按一定l: 6的比 例稀释。反应试管中依次加入E3标准品(或待测物)、》兹性」微粒子各100iLi l以 及50 pi 125I-E3 ( 35000cpm), 3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于雌三醇检测的磁性微粒子免疫分析法，其特征在于：将成品磁性微粒子用洗涤液进行充分洗涤，每次洗涤后用磁性分离器使磁性微粒子充分沉淀，弃去上清液；洗涤后的磁性微粒子用稀释液稀释还原至原体积，加入适量ａｎｔｉ－Ｅ３血清室温震荡条件下进行包被，抗体血清可直接加入，不需要经过纯化处理；反应结束后，分离、洗涤，加入封闭液，室温振荡封闭，封闭后的磁性微粒子用磁性微粒子稀释液稀释还原至原体积，在４℃条件下可保存一年以上；使用包被有ａｎｔｉ－Ｅ３的磁性微粒子测定雌三醇时，用磁性微粒子稀释液将其按１∶６的比例进一步稀释后，作为固相抗体直接参与免疫反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林金明，吴丹凝，王栩，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]