同时分析烟草及其制品20种氨基酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时分析烟草及其制品２０种氨基酸的方法，采用液相色谱和电喷雾串联质谱联用，包括烟草样品经前处理得到提取液、提取液在反相色谱柱上以二元流动相梯度洗脱和制作两条标准曲线，采用液相色谱－电喷雾离子阱串联质谱在正离子模式下进行烟草中２０种氨基酸的分析检测的实验步骤。本发明专利技术方法烟草样品萃取完过滤后直接进样，无需进行衍生和固相萃取等其他前处理，简便快捷；对待测物的色谱分离度要求降低，可有效的解决共流出问题，同时解决了氨基酸同分异构体的分离检测问题，建立了同时对烟草中２０种非衍生化氨基酸的快速分析方法，重现性好、灵敏度和选择性高，大大简化了分析步骤，提高了分析效率，可成功应用于对各种烟草样品氨基酸的分析测定中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学分析检测
，具体涉及一种同时分析烟草 及其制品20种氨基酸的方法。
技术介绍
氨基酸是烟叶中的重要组成部分，是与烟气香味、巻烟品质和品 牌特征密切相关的烟草成分，氨基酸参与烟叶中的非酶棕色反应，即 美拉德反应，此反应可产生多种重要的致香成分。因此，测定烟草中 的氨基酸对配方研制、工艺生产和品质控制都有十分重要的意义。由于烟草中的氨基酸种类较多，且具有酸性、中性和碱性三种不 同的化学性质，加上烟草基质复杂，因此对烟草中多种氨基酸的同时 测定具有一定难度。目前，液相色谱(LC)法是较多使用的氨基酸测 定方法之一。由于氨基酸不具有紫外和荧光检测所需的发色基团，若 用液相色谱法进行检测，则必须对氨基酸进行柱前或柱后衍生。衍生 化操作步骤繁琐，耗时耗力，而且衍生化合物的稳定性难以直观的评 判，某些氨基酸衍生反应的完全程度也难以保证，同时衍生反应还可 能生成非目标衍生物，这些都会影响氨基酸的准确测定。自动氨基酸 分析仪也存同样的衍生问题。烟草成分相当复杂，用LC、自动氨基酸分析仪、离子色谱(IC) 和毛细管电泳(CE)等方法进行氨基酸分析往往需要对样品进行固相 萃取等繁杂的前处理，以减少干扰。现有的固相萃取等前处理会在一定程度上造成某些氨基酸(或氨基酸衍生物)的损失，而且有些干扰 杂质也难以通过前处理消除。近年来，随着电喷雾离子化(ESI)和串联质谱(MS/MS)技术 的发展，液相色谱和电喷雾串联质谱联用(LC-ESI-MS/MS)在复杂 化合物分析中得到广泛的应用。LC-MS/MS方法的灵敏度高，选择性 优异。由于MS/MS具有特征离子提取功能，与色谱方法相比，对待测 物的色谱分离度要求并不难么严格。利用液相色谱与电喷雾离子阱串 联质谱(LC-ESI-MS/MS)联用技术同吋对烟草中20种非衍生化氨基 酸的快速分析方法目前未见相关的技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术不足，提供一种同时分析烟草及其 制品20种氨基酸的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来予以实现提供一种，采用液相 色谱和电喷雾串联质谱联用，包括以下步骤(1) 烟草样品经前处理得到提取液；(2) 提取液在反相色谱柱上以二相流动相梯度洗脱；(3) 制作两种不同浓度系列的标准曲线，采用液相色谱-电喷雾 离子阱串联质谱在正离子模式下进行烟草中20种氨基酸的分析检步骤(1)所述前处理包括采用含正缬氨酸浓度为1.7jiM的HC1 溶液为萃取溶液，在超声震荡下萃取烟末；萃取液过滤。所述HC1溶液浓度为0.03 0.1M，优选浓度为0.03M。所述萃取烟末与萃取溶液的比例为0.1 0.2g: 20ml;萃取时间 为15min;所述过滤是采用0.2 |im滤膜过滤。步骤(2)所述反相色谱柱为HyPURITYds;所述二元流动相为 99%水-1%乙腈-0.1%九氟戊酸和10%水-90%乙腈-0.1%九氟戊酸。步骤(3)所述制作两种浓度系列的标准曲线是(1) 配制含内标正缬氨酸浓度为1.7 )LiM的氨基酸混和标准溶液I ，其中天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、谷氨酸、胱氨酸、 "氨基丁酸、哌啶酸、缬氨酸、甲硫氨基酸、组氨酸、酪氨酸、赖氨 酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的浓度均为50 pM 的0.03MHC1溶液；(2) 配制含内标正缬氮酸浓度为1.7 的氨基酸混和标准溶液II ，其中脯氨酸和天冬酰胺的浓度分别为500 (iM的0.03M HC1溶液；(3) 用含正缬氨酸浓度为1.7 的0.03 M HC1把标准溶液I 和标准溶液II配成系列浓度，制作标准曲线。步骤(3)所述液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱的测定条件为氮气压力0.64 MPa;氦气压力0.38 MPa;极性正电离；扫描形 式全扫描；采集时间40min;激活时间30ms;吹扫气OLTQ 单位；喷雾电压5 kV;毛细管温度350°C;扫描范围标准；扫 描速率标准；分段。所述分段是分为4段，其中第3分段的鞘气和 辅助气分别为38 LTQ单位和0 LTQ单位，其余分段的鞘气和辅助气 分别为46 LTQ单位和19 LTQ单位。本专利技术的有益效果是(1) 烟草样品萃取完过滤后直接进样，无需进行衍生和固相萃 取等其他前处理，大大简化了分析步骤，提高了分析效率；(2) 与单纯的色谱分析方法相比，对待测物的色谱分离度要求 并不那么严格，可有效的解决共流出问题；(3) 本专利技术利用液相色谱分离方法，解决了氨基酸同分异构体 的分离检测问题，建立了同时对烟草中20种非衍生化氨基酸的快速 分析方法，重现性好、灵敏度和选择性高，可成功应用于对各种烟草 样品氨基酸的分析测定中。综上所述，本专利技术建立了一种简便、高效、高灵敏度和高选择性 的非衍生化氨基酸的测定方法。本专利技术通过色谱分离和质谱的离子提 取，大大简化了样品前处理，方便了待测氨基酸的定性定量分析，有 效的解决了液相色谱方法较难解决的共流出问题，方法稳定性好，可 直接作为常规检测方法用于对各种烟草中氨基酸的分析，为配方研 究、产品设计、工艺生产以及品质控制提供重要的氨基酸参考数据。LC-MS方法能方便的实现对烟草中多种氨基酸的同时分析，如烟草 中的L-哌啶-2-羧酸(L-Pip)，目前尚未见到在测定常见烟草氨基酸的 同时测定L-Pip的其他分析方法。 附图说明图1 20种氨基酸和内标正缬氨酸的提取离子流图 图2加标前lie和Leu提取离子流图 图3加标后lie和Leu提取离子流图图4 加标前Val和Nva提取离子流图图5加标后Val和Nva提取离子流图图6 图26 氨基酸的二级质谱图 具体实施例方式下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本专利技术。 实施例11、 仪器、材料与试剂美国热电公司LC-MS LTQ液相色谱-离子阱质谱仪，配备自动进 样器、四元梯度质谱泵，LTQ离子阱质谱带电喷雾电离源(ESI)， Xcalibur 1.4 SR1系统控制软件；意大利Claind N2LCMS氮气发生 器；法国Millipore Element A10纯水机；美国Cole-Parmer 8892超 声清洗器；Sartorious CP225D电子天平(Max 220g， d = 0. 01 mg (80 g)， 0.1 mg (220g)); Whatman 0. 2 urn尼龙针式滤头；烟草粉末。混合氨基酸标准溶液(Fluka公司)，含17种氨基酸，浓度各为 ImM;内标物L-正缬氨酸(上海丽珠东风生物技术有限公司)；天冬 酰胺.水(上海伯奥生物科技有限公司)；色氨酸，脯氨酸和谷氨酰胺 (国药集团化学试剂有限公司)；Y-氨基丁酸(Sigma公司)；L-哌啶 -2-羧酸、九氟戊酸(NFPA) (Aldrich公司)；甲醇和乙腈(MERCK公 司)；优级纯浓盐酸；Milli-Q级水，由Milliore Element A10制备， 若不经特别说明，实验中用水均为Milli-Q级水。 2、实验方法2. 1样品处理称取O. 1 0.2g烟末置于锥形瓶中，加入20mL含正缬氨酸浓度 为1. 7|iM的0. 03MHC1溶液，超声震荡15min，摇荡锥形瓶片刻使溶 液浓度分配均匀，经0. 2Mffl滤膜过滤后直接进样。2. 2 色谱条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时分析烟草及其制品２０种氨基酸的方法，其特征在于采用液相色谱和电喷雾串联质谱联用，包括以下步骤：　（１）烟草样品经前处理得到提取液；　（２）提取液在反相色谱柱上以二元流动相梯度洗脱；　（３）制作两种不同浓度系列的标准曲线，采用液相色谱－电喷雾离子阱串联质谱在正离子模式下进行烟草中２０种氨基酸的分析检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翼飞，
申请(专利权)人：广东中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]