本发明专利技术描述了用于检测抗类脂抗体和诊断疾病例如梅毒的组合物、方法和装置。尤其是描述了氧化心磷脂，其可以与各种各样的连接分子如ＢＳＡ、ＫＬＨ、生物素、合成蛋白质ＭＡＰＳ、ＩｇＹ、链霉亲和素或亲和素偶联。这种氧化心磷脂，单独或与一种或多种连接分子复合，在例如，用于侧流装置时，可用来检测对象的抗类脂抗体。还描述了可以检测抗类脂抗体和可以共同检测生物样品中的非密螺旋体和密螺旋体抗体的侧流装置。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
0003]本公开内容涉及改性心磷脂组合物及其用途；尤其涉及将改性心磷脂固定至固体支持物上的方法，以及相关的免疫分析(如ELISA)和免疫分析装置(如测试条，流通装置或侧流装置)，所述分 析和装置可以用于，例如，抗类脂抗体的检测和/或疾病(如梅毒)的 诊断。
技术介绍
根据一些专家，为了筛查和诊断的目的，非密螺旋体试验 和密螺旋体试验的组合将进一步帮助梅毒检测。这是世界卫生组织 (World Health Organization)提倡的方法，密螺旋体感染(Treponemal Infections)，技术报告丛书(Technical Report Series) 674，日内瓦 WHO, 1982。使用方便、快速、护理现场的检验，其能同时检测非密 螺旋体和密螺旋体抗体，将有助于解决这一长期存在的需求。专利技术概述图3显示了含有4条十八碳双不饱和脂肪酸链的例示性心 磷脂分子的示意性氧化反应。图示的心磷脂反应产物具有1条或4条 氧化的脂肪酸侧链。实际上，氧化反应产物还包括氧化的心磷脂种类， 其中任何两条或三条脂肪酸链被氧化成羧基。00221图4显示了用于将氧化的心磷脂与含胺连接分子，如蛋白 质共价结合的示意性反应。在图示的例子中，连接分子是BSA。0023图5显示了用来测定氧化的心磷脂-BSA偶联物(表2中的"制品5")抗原性的斑点印迹分析的数字图像。{00241图6显示了可以使用本公开方法的侧流装置的5种不同形 式实施方案的数字图像。(A) 、 (B)和(E)中所示的装置实施方 案装配得使其各自可以浸入或部分浸没在样品或含有样品的溶液中。 (C)和(D)中所示的装置实施方案装配成接纳一定体积的滴入进样 口的样品(或含有样品的溶液)。0025图7是侧流装置的一种形式实施方案的透视图，其中去掉 了部分外壳，以显示该装置的基本组件及其相互关系。00261图8显示了氧化的心磷脂-卵磷脂混合物的薄层色谱的数 字图像。(A)未改性心磷脂和未改性卵磷脂在正丁醇中的混合物；(B) 氧化的心磷脂/卵磷脂混合物；(C)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的 上层正丁醇相；和(D)心磷脂/卵磷脂混合物氧化过后的下层水相。 各样品的迁移方向用箭头表示。在一种应用中，与多肽载体偶联的氧化心磷脂可以用来通 过将心磷脂-多肽偶联物连接至侧流基体如硝化纤维素条来制造侧流色谱装置。提供多肽偶联的心磷脂的能力使得心磷脂可靠地连接在固体 基体上。该基体还可以包括与梅毒密螺旋体抗体反应的密螺旋体抗原。 同一固体支持物上(或中)心磷脂-多肽偶联物和密螺旋体抗原的存在 方便地可以在临床上快速测试同一生物样本中的抗脂质和抗密螺旋体 抗体。00331本文还公开了用于测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/ 或量的免疫分析装置(如侧流或流通装置)。这些装置通常包括加样 区和其中提供了固定的心磷脂-多肽偶联物的独立的心磷脂俘获区，所 述偶联物对流动相抗类脂抗体具有特异性结合亲和力。加在加样区中 的任何液体(如流体生物样品)沿着流径从加样区流向心磷脂俘获区。 流径可以延伸至下游的与免疫分析装置连接的吸收垫，其至少部分起 到贝i液器的作用。可以检测抗类脂抗体和固定的氧化心磷脂之间复合 物的形成，以测定流体样品中抗类脂抗体的存在和/或量。 用于本文所公开的方法和装置的一些实施方案的抗类脂 抗体可以是任何起源，但最经常发现于对象的血清。 抗体可以是单克隆或多克隆的。只作为举例，单克隆抗体 可以根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256:495-497， 1975)或 其衍生方法从鼠杂交瘤制备。简而言之，小鼠在几周时间内重复接种 几微克的所选分析化合物(或其片段)。在一些情况下，使用佐剂或 载体分子对增加分析物在动物系统中的免疫原性和/或稳定性有益。然 后处死小鼠，分离产生抗体的脾细胞。用聚乙二醇使脾细胞与小鼠骨 髓瘤细胞融合，过量未融合的细胞通过使系统在包含氨基蝶呤的选择 性培养基(HAT培养基)上生长来破坏。将成功融合的细胞稀释，取 等份稀释液置于微量滴定板的孔中，继续培养物的生长。产生抗体的 克隆通过用免疫分析程序，如最初由Engvall描述的ELISA (Meth. Enzymol. 70:419-439, 1980)及其衍生方法检测孔的上清液中的抗体来 鉴别。所选的阳性克隆可以扩增，收集其单克隆抗体产物待用。Harlow 和Lane (抗体，实验室手册(Antibodies, A Laboratory Manual) , CSHL, New York, 1988)中描述了单克隆抗体产生的详细程序。 抗原可以刺激动物中抗体产生或T细胞反应的化学或生 物化学化合物、组合物、结构、决定簇、抗原或其部分，包括注射或 吸收进入动物的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物，包括 由异种免疫原诱导的那些反应。术语"抗原"包括所有相关的抗原表 位。心磷脂是响应疾病状态如梅毒密螺旋体感染而形成的抗 类脂抗体的一种通常已知的特异性结合配偶体。天然存在的心磷脂已 经常规用于联合胆固醇和卵磷脂使用，用于絮凝试验,以检测例如， 梅毒密螺旋体感染患者血清中的抗类脂抗体。俘获试剂对以下物质具有特异性的未标记的特异性结合配偶体(i)分析物，如在三明治分析中，或(ii)检测试剂或分析物，如在竞争性分析中，或(iii)辅助特异性结合配偶体，其本身对分析物 具有特异性，如在间接分析中。本文所用的"辅助特异性结合配偶体" 是与分析物的特异性结合配偶体结合的特异性结合配偶体。例如，辅 助特异性结合配偶体可以包括对另一个抗体特异的抗体，例如，山羊 抗人抗体。"俘获区"是侧流装置中俘获试剂被固定的区域。侧流装 置可以具有一个以上的俘获区，例如，"第一俘获区"，"第二俘获区"等。通常，第一、第二或其它俘获区中将固定不同的俘获试剂。 侧流基体上的多个俘获区可以彼此具有任何取向；例如，第一俘获区 可以在第二 (或其它)俘获区的远端或近端，反之亦然。或者，第一俘获区和第二 (或其它)俘获区可以彼此垂直取向，这样，这两个(或 更多个)俘获区便形成了交叉或加号或其它符号。0066偶联(物)当用于动词形式时，术语"偶联"的意思是 一个分子(例如，氧化的心磷脂)与另一个分子(例如，蛋白质)的 共价偶联。这种偶联可以通过化学方法、用或不用连接基团完成。当 用于名词形式时，术语"偶联物"的意思是通过偶联形成的偶联分子 络合物。还原剂任何将来自心磷脂氧化的^-酮基还原成相应的 /3-羟基而不引起其它氧化心磷脂官能团如脂肪酸酯基和/或磷酸酯的大 量降解的还原剂。本领域技术人员可以从，例如，Larock， Comprehensive Organic Transformations (综合有机转化)，第二版，New York: John Wiley & Sons, 1999的教示中选择合适的还原剂。还原剂的具体例子包 括亚硫酸氢钠，硫酸二甲酯，氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，硼氢化钠 (NaBH4)，三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3),吗啉硼烷，三异丙氧基硼氢化钾，叔丁胺硼垸，二甲胺硼垸，吡啶硼烷，三乙胺硼垸， 三甲胺硼烷。心磷脂是双磷脂酰甘油(具体为1，3-双磷脂酰甘油)，如 本文档来自技高网...
【技术保护点】
与抗类脂抗体具有免疫反应性、并且能结合蛋白质以连接至基体上的氧化心磷脂的制备方法，其中心磷脂包括中心甘油部分和脂肪酸侧链，该方法包括： 使心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应，以氧化心磷脂的脂肪酸侧链，从而在一条或多条侧链上提供末端羧基； 在心磷脂与高碘酸盐和高锰酸盐反应后，向心磷脂悬浮液中加入还原剂，以淬灭心磷脂的氧化和将中心甘油部分中形成的β－酮还原成β－羟基，从而保留中心甘油部分的免疫原性；以及 活化氧化心磷脂的羧基，使蛋白质载体与至少一个羧基共价连接。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿诺德R卡斯特罗，王慧英，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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