用于测量微生物生物质的改进方法技术

本发明专利技术涉及一种用于定量或定性测定样品中至少一种感兴趣的真菌的方法，其中使用了测定来源于真菌的酶活性的测定。此外，添加了优先抑制样品中潜在存在的其他细胞中的相应酶活性的酶抑制剂，以使来自这些其他细胞的假阳性酶活性测量最小化。还提供了一种试剂盒，其包含待测定的酶的底物和酶活性的抑制剂。此外，本发明专利技术还涉及一种用于测定包含其他生物质的样品中的真菌细胞的相对浓度/数量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量微生物生物质的改进方法专利
本专利技术涉及微生物的检测，特别是真菌例如霉菌的检测。更具体地，本专利技术涉及用于检测真菌的改进方法，其中显著改善了所检测信号中的信噪比。专利技术背景国际专利公开WO98/033934描述了一种通过测量样品中β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(以下称为“NAHA”)的活性水平来定量真菌生物质的方法。已发现NAHA存在于菌丝和孢子中，并且具有可测量的活性。此外已显示，在不同类型的环境样品中，NAHA活性与真菌生物质具有良好的相关性。可以快速测量作为环境样品中真菌生物质的标志物的NAHA活性，从而在数分钟而不是数天(其在使用传统培养方法时是典型的)的时间内提供结果。当在基于培养基的方法中将真菌测量为菌落形成单位(CFU)时，一种孢子将原则上产生一个单菌落，而菌丝体样品(其本质上包含多个细胞)也将产生一个单菌落，因此也算作一个孢子。与孢子相比菌丝生长形式的这种固有的代表性不足是严重的，因为丝状真菌的生长由大约95-100％的菌丝组成。但是，NAHA活性以每个生物质单位大致相同的水平同时存在于菌丝和孢子中。这意味着NAHA活性的定量提供了总真菌生物质(即单个细胞的数量或浓度)的更准确的代表性测量；换句话说，NAHA活性与真菌生物质之间的相关性优于CFU与真菌生物质之间的相关性。NAHA活性在所有丝状真菌中大量存在，但是与几乎所有其他酶活性一样，它并不是真菌独有的。因此，在某些情况下，使用NAHA活性作为定量真菌的工具可能会由于测量到的非真菌NAHA活性而导致真菌生物质的明显高估。在例如如果样品包含室内尘埃时就是这种情况，该室内尘埃除真菌孢子外还可能包含花粉、宠物皮屑、人皮肤细胞和屋尘螨，所有这些都表现出一定程度的NAHA活性。同样，从可能存在非真菌NAHA活性的植物表面或其他表面取样也存在高估真菌NAHA活性的相同风险。血液样品中真菌的检测是另一个例子。人血含有NAHA活性，并且能够选择性抑制人NAHA活性的能力可以允许检测真菌NAHA活性的存在，因此使得真菌病的诊断筛选工具成为可能。当基于酶活性测定其他特定的微生物群或物种时，可能会出现类似的问题。在感兴趣的不只是测定样品中微生物生物质的总量时，从被选为感兴趣的生物质子集的替代物的相似、同源或相同的酶测量的活性将构成测量的信号中的“噪声”，并能够产生大量的假阳性结果。因此，需要在环境样品中进行与WO98/033934中公开的测量以及WO2005/083109中公开的测量相对应的测量时，能够减少来自“无关”微生物的竞争信号。专利技术目的本专利技术的实施方案的一个目的是基于样品中存在的真菌细胞的酶活性提供对测定真菌细胞(特别是在环境中)的改进。本专利技术的实施方案的另一个目的是提供一种用于真菌测定的测试试剂盒。专利技术概述本专利技术基于在专注于鉴定抑制剂的研究中的发现，所述抑制剂可以选择性地抑制其中要测定真菌(通常是霉菌)的系统中来自非真菌来源的NAHA的酶。酶的活性可以被大量抑制剂竞争性或非竞争性地抑制。使用不同类型的抑制剂进行研究工作，本专利技术人鉴定了不同类型的酶抑制剂，它们在实验设置中显示对来自真菌的NAHA活性几乎没有抑制作用，但对来自许多非真菌来源的NAHA活性却显示出令人惊讶的强烈抑制作用。已经令人惊讶地发现，NAHA活性的特异性抑制剂和酶活性的一般抑制剂都发挥相同的选择作用，即优先抑制细胞/生物体中的NAHA活性的能力，所述细胞/生物体会在基于NAHA的测量来测定真菌细胞时产生假阳性结果。测试了金属离子，如Ag+、Hg+和Cu2+，以及更特异的NAHA抑制剂，即氮杂糖2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素(DNJNAc)。β-N-乙酰基己糖胺酶的特异性抑制剂已经受到了广泛关注，主要是为了用于阐明β-N-乙酰基己糖胺酶在生物过程中的作用以及还用于开发治疗干预的工具。以前似乎没有考虑过在基于酶的真菌细胞测定中将这类抑制剂用作为信号增强剂的具体用途。因此，在第一方面，本专利技术涉及一种用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中-底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，以及-在反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对底物的酶促转化的优先抑制剂。在第二方面，本专利技术提供了一种用于测定感兴趣的真菌细胞的试剂盒，其包含-底物，其可以通过感兴趣的真菌细胞以及无关细胞在NAHA中转化，-无关细胞对底物的转化的至少一种抑制剂。本专利技术第三方面涉及一种用于测定一个位置中至少一种感兴趣的真菌与同一位置中至少一种无关细胞相比的相对量的方法，其包括以下步骤：1)使来自所述位置的样品与第一底物接触或混合以产生第一反应混合物，并随后测定在产生第一反应混合物后第一底物的转化率，2)使来自所述位置的样品与第二底物接触或混合以产生第二反应混合物，并随后测定在产生第二反应混合物后第二底物的转化率，以及3)通过计算在步骤1中测定的转化率与在步骤2中测定的转化率之间的比率来测定至少一种感兴趣的真菌的相对量，其中-第一和第二底物可以被至少一种感兴趣的真菌产生的NAHA和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，-在第一反应混合物中存在至少一种无关细胞产生的NAHA对第一底物的酶促转化的优先抑制剂，和在第二反应混合物中不存在NAHA对第二底物的酶促转化的优先抑制剂。附图说明图1显示了各种样品中相对霉菌水平的百分比分布。图2显示了来自被认为没有霉菌问题的位置(带“/”的阴影)和已知有霉菌问题的位置(带“\”的阴影)的样品中相对霉菌水平的百分比分布。专利技术详述定义在本说明书和权利要求书中，“微生物”是单细胞生物(例如原核生物，例如细菌或古细菌，或单细胞真核生物，例如原生生物、原生动物、藻类、单细胞真菌，例如酵母或裂殖酵母)或可以是多细胞的生物(例如丝状真菌)。还包括的是微生物是在单细胞形式和多细胞形式之间切换的那些生物，即粘液霉菌，和某些真菌和藻类。根据本专利技术，特别感兴趣的是将本文公开的方法应用于真菌，特别是丝状真菌/霉菌。“底物”是可以经历酶催化转化的物质。任何这样的转化都可以是感兴趣的，只要可以检测并区分底物和对底物的酶促作用的至少一种产物。例如，底物在特定测定中可能是不可检测的，而产物是可检测的，反之亦然；或者底物和产物两者可以在测定中是可检测的但也是可区分的。在本文的上下文中，“反应混合物”是至少包含样品、底物和任选地优先抑制剂的混合物。取决于其中反应混合物是不可分割的部分的测定的精确设计，可以存在其他成分。“优先抑制剂”是这样一种物质，其在测定所规定的条件(化学和物理条件以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中/n-所述底物可以被所述至少一种感兴趣的真菌产生的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，以及/n-在所述反应混合物中存在所述至少一种无关细胞产生的NAHA对所述底物的酶促转化的优先抑制剂。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180207 EP 18155604.4;20180410 EP 18166640.51.一种用于定量或定性测定样品中的至少一种感兴趣的真菌的方法，所述方法包括将样品与底物接触或混合以产生反应混合物，并随后根据产生反应混合物之后反应混合物中底物的所测量的转化率评估所述样品中至少一种感兴趣的真菌的数量或浓度，其中
-所述底物可以被所述至少一种感兴趣的真菌产生的β-N-乙酰基己糖胺酶3.2.1.52(NAHA)和至少一种无关细胞产生的NAHA转化，以及
-在所述反应混合物中存在所述至少一种无关细胞产生的NAHA对所述底物的酶促转化的优先抑制剂。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的真菌是含有NAHA的真菌颗粒，例如菌丝或孢子、菌丝碎片或具有小于1μm的尺寸的菌丝微片段形式的丝状真菌细胞。


3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中被NAHA转化的产物是可检测的和/或其中未转化的底物是可检测的。


4.根据权利要求3所述的方法，其中通过测量转化产物的量的增加和/或底物的量的减少来测量转化率。


5.根据权利要求3或4所述的方法，其中可检测的产物和/或可检测的底物是有色的、发光的、荧光的、生色的、酶活性的或是捕获剂的特异性结合伴侣。


6.根据权利要求5所述的方法，其中可检测的底物和/或产物是荧光的，并且其中在将底物添加至样品之后测量荧光的变化。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其中间歇地或连续地，优选在约30分钟的时间内测量荧光。


8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中在将底物添加至样品之后的一个或几个时间点测量荧光。


9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中相比于抑制所述至少一种感兴趣的真菌对底物的转化，所述抑制剂优先抑制所述至少一种无关细胞对底物的转化。


10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述底物在被NAHA转化时释放4-甲基伞形酮或其荧光可检测的衍生物，例如选自以下的甲基伞形基衍生物：4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，吲哚基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖-吡喃糖苷，4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，β-三氟甲基伞形基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，N-甲基-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，5-碘-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖，4-甲基伞形基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧)-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基α-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形基β-D-岩藻糖苷，4-甲基伞形基α-D-葡糖苷，4-甲基伞形基-7-(6-磺基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷)，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基β-D-乳糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰胺基半乳糖苷，4-甲基伞形基β-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基α-D-吡喃甘露糖苷，4-甲基伞形基β-D-木糖苷，试卤灵-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，4-甲基伞形基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷，9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(DDAO)和DDAO的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷低聚衍生物，优选4-甲基伞形基-β-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷和4-甲基伞形基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖苷。


11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抑制剂是非特异性NAHA抑制剂，例如选自Ag+、Hg2+和Pb2+的金属离子。


12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述抑制剂是特异性抑制NAHA的抑制剂，例如2-乙酰胺基-1,2-二脱氧野尻霉素。


13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述优先抑制剂
-在产生反应混合物之前与底物混合或接触，或
-在产生反应混合物时与底物同时添加至样品，或
-在产生反应混合物之前添加至样品。


14.根据权利要求13所述的方法，其中如果在产生反应混合物之前将抑制剂添加至样品，则在产生反应混合物之前最多2小时将抑制剂添加至样品，例如在产生反应混合物之前最多115分钟，最多100分钟，最多105分钟，最多100分钟，最多95分钟，最多90分钟，最多85分钟，最多80分钟，最多75分钟，最多70分钟，最多65分钟，最多60分钟，最多55分钟，最多50分钟，最多45分钟，最多40分钟，最多35分钟，最多30分钟，最多25分钟，最多20分钟，最多15分钟，最多10分钟和最多5分钟。


15.一种用于测定感兴趣的真菌细胞的试剂盒，其包含
-底物，其可以通过感兴趣的真菌细胞以及无关细胞在NAHA催化的反应中转化，
-无关细胞对底物的转化的至少一...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·里斯列夫，
申请(专利权)人：麦卡米特有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK