基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用，属于烟草抗病技术领域，其技术方案包括提供了一种基因G20E03，基因G20E03编码的蛋白，蛋白在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用及基因G20E03在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用，通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株，在转基因烟草植株中表达基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊线虫基因G20E03沉默，缓解基因G20E03对烟草植株的免疫抑制作用，提高烟草植株的抗大豆孢囊线虫病性。本发明专利技术应用于烟草抗病方面，具有能够大量表达烟草大豆孢囊线虫效应蛋白基因的dsRNA，及显著抑制大豆孢囊线虫寄生的特点。通过本发明专利技术可获得强抗大豆孢囊线虫病的烟草植株。

【技术实现步骤摘要】
基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用
本专利技术属于烟草抗病
，尤其涉及一种基因G20E03、其编码的蛋白及其在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。
技术介绍
大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines，soybeancystnematode，SCN)是植物内寄生线虫，主要侵染大豆(Glycinemax)等豆科植物，烟草(Nicotianatabacum)是其非寄主。但近年来，在山东地区发现一个特殊的能够侵染烟草的SCN群体(Tobaccopopulationofsoybeancystnematode，SCNT)。利用形态学及分子生物学等鉴定手段，将山东省寄生烟草的孢囊线虫鉴定为大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines)。受SCNT侵染的烟草根系，其分叉变多，后期会着生小米粒大小的白色或黄色球形颗粒(孢囊线虫的雌虫)，部分受侵染根系出现褐色坏死，最后整条根腐烂、干枯。孢囊线虫危害烟草的根系，不仅会导致烟叶产量损失和品质下降，而且会加重烟草上其他病害(如烟草枯萎病)的发生，已成为严重制约我国山东、河南等地烟区生产的重要因素之一。目前防治孢囊线虫的方法主要有轮作、化学防治和选育抗病品种，但是由于轮作的局限性和化学防治给生态环境造成的巨大污染，以及抗线虫种质资源的匮乏，寻找高效的、可持续的大豆孢囊线虫防治方法是目前植物寄生线虫研究领域的重点。通过基因技术获得抗病植株是防治农作物病害的有效手段，然而，由于现有技术对于SCNT的研究仅停留在对比SCN与SCNT的致病差异性上，由于SCNT特殊的致病力，使得通过基因技术筛选得到强致病因子并获得抗大豆孢囊线虫病的烟草植株仍存在很高的技术难度。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足之处，本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术难点，系统运用基因技术筛选得到强致病因子并获得抗大豆孢囊线虫病的烟草植株，从而有效解决烟草病害的技术问题，提供一种能够大量表达烟草大豆孢囊线虫病效应蛋白基因的dsRNA，及有效防治烟草大豆孢囊线虫病的方法。为解决所述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提出基因G20E03，所述基因G20E03的基因全长序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述基因G20E03的基因全长序列包括5’端非编码区、3’端非编码区和cDNA区，所述cDNA区的基因序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述基因G20E03由以下方法克隆得到：使用TRIZOL法提取大豆孢囊线虫烟草群体的2龄幼虫RNA，并反转录为cDNA；根据SCNT的转录组测序结果设计引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，对所述PCR产物进行纯化及T-A连接，得到连接产物，将所述连接产物转入大肠杆菌中，随机挑取单菌落，利用所述引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R对所述单菌落进行PCR筛选，得到阳性单克隆菌落并测序；根据上述的G20E03基因部分序列，设计5’端非编码区和3’端非编码区基因的特异引物G20E03-5’-R和G20E03-3’-F，PCR扩增，5’端扩增出260bp的片段，3’端扩增出666bp的片段；对上述序列进行拼接，克隆得到所述基因G20E03的基因全长序列。本专利技术另一方面提供了以上任一技术方案所述的基因G20E03编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了上述蛋白在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。本专利技术还提供了以上任一技术方案所述的基因G20E03在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。优选的，包括以下步骤：通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株，在转基因烟草植株中表达基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊线虫基因G20E03沉默，缓解基因G20E03对烟草植株的免疫抑制作用，提高烟草植株的抗大豆孢囊线虫病性。优选的，所述通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株包括以下步骤：构建重组表达载体pFGC5941-RNAi-G20E03；将重组表达载体pFGC5941-RNAi-G20E03转化农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌；通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草，进行组织培养，分别利用引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R检测均为阳性的转基因烟草植株即为G20E03的RNAi转基因烟草植株。优选的，所述构建重组表达载体pFGC5941-RNAi-G20E03包括以下步骤：以大豆孢囊线虫cDNA为模板，采用RACE法克隆G20E03基因，得到完整的基因序列；设计引物对G20E03-ORF-R-F和G20E03-ORF-R-R，PCR扩增得到含Xbal和BamHI酶切位点的ORF反向序列，分别使用限制性内切酶Xbal和BamHI进行酶切，纯化回收后，连接至经限制性内切酶Xbal和BamHI酶切的植物干扰载体pFGC5941，获得重组表达载体pFGC5941-G20E03；设计引物对G20E03-ORF-F-F和G20E03-ORF-F-R，PCR扩增得到含NcoI和SwaI酶切位点的ORF正向序列，分别使用限制性内切酶NcoI和SwaI对重组表达载体pFGC5941-G20E03进行酶切，纯化回收后，连接至经限制性内切酶NcoI和SwaI酶切的载体pFGC5941-G20E03，获得重组表达载体pFGC5941-RNAi-G20E03。优选的，通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株还包括：将T0代转基因烟草种子采用种子穴盘育苗，并分别利用特异性引物G20E03-part-F和G20E03-part-R、Bar-F和Bar-R进行PCR检测，得到T1代转基因烟草；按照上述方法逐代培养，得到纯合的转基因株系。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种能够提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病的基因G20E03及其编码的蛋白，并证明了该基因编码的蛋白在大豆孢囊线虫寄生烟草中发挥重要作用，能够抑制烟草免疫反应，通过转基因技术实现对基因G20E03的沉默表达，从而提高烟草抗孢囊线虫的能力，对培育抗大豆孢囊线虫的烟草品种奠定了良好的理论和实践基础。附图说明图1为G20E03基因在侵入寄主前后不同时间点下的表达量，其中，pre-J2为SCNT侵染前2龄幼虫，小写字母代表差异显著性P<0.05；图2为扩增G20E03基因部分序列的电泳结果，其中，M：DL2000Marker，1：G20E03部分片段；图3为RACE克隆G20E03基因电泳结果，其中，A：扩增G20E03基因5’区序列的电泳结果，M：DL2000Marker，1：G20E035’片段，B：扩增G20E03基因3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因G20E03，其特征在于，所述基因G20E03的基因全长序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.基因G20E03，其特征在于，所述基因G20E03的基因全长序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的基因G20E03，其特征在于，所述基因G20E03的基因全长序列包括5’端非编码区、3’端非编码区和cDNA区，所述cDNA区的基因序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求2所述的基因G20E03，其特征在于，所述基因G20E03由以下方法克隆得到：
使用TRIZOL法提取大豆孢囊线虫烟草群体的2龄幼虫RNA，并反转录为cDNA；
根据SCNT的转录组测序结果设计引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，对所述PCR产物进行纯化及T-A连接，得到连接产物，将所述连接产物转入大肠杆菌中，随机挑取单菌落，利用所述引物对G20E03-part-F和G20E03-part-R对所述单菌落进行PCR筛选，得到阳性单克隆菌落并测序；
根据上述的G20E03基因部分序列，设计5’端非编码区和3’端非编码区基因的特异引物G20E03-5’-R和G20E03-3’-F，PCR扩增，5’端扩增出260bp的片段，3’端扩增出666bp的片段；
对上述序列进行拼接，克隆得到所述基因G20E03的基因全长序列。


4.根据权利要求1-3任一项所述的基因G20E03编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.根据权利要求4所述的蛋白在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。


6.根据权利要求1-3任一项所述的基因G20E03在提高烟草植株抗大豆孢囊线虫病中的应用。


7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：通过转基因技术获得基因G20E03的RNAi转基因烟草植株，在转基因烟草植株中表达基因G20E03的dsRNA，使大豆孢囊线虫基因G20E03沉默，缓解基因G20E03对烟草植株的免疫抑制作用，提高烟草植株的抗大豆孢囊线虫病性。

【专利技术属性】
技术研发人员：宋雯雯，史倩倩，刘兰亭，赵洪海，梁晨，段方猛，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37