本发明专利技术公开一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束及其制备方法；是合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯‑聚乳酸PLA‑PEG‑OTs）；制备阿霉素胶束（ADR‑PMs）；制备NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（ADR‑PMs‑NPMBP）。该NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束的体外癌细胞抑制试验表明，对急性淋巴细胞白血病细胞具有良好的抑制活性，有望被开发为临床抗白血病药物，具有较大的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束及其制备方法
本专利技术具体涉及一种具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束的制备方法。
技术介绍
纳米载药系统，可增强药物的肿瘤靶向输送效率。NPM1结合蛋白可特异靶向NPM1蛋白，而NPM1蛋白在难治复发ALL病人中高表达，并与耐药相关。将NPM1结合蛋白与常用化疗药物阿霉素通过纳米载药系统偶联，可望产生较好的靶向性和抗癌活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束及其制备方法，通过合成聚合胶束，丙酮溶剂蒸发法合成阿霉素胶束，并将NPM1结合蛋白偶联至胶束，制成NPM1结合蛋白纳米载药胶束。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1）合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸PLA-PEG-OTs）；2）制备阿霉素胶束（Adriamycin-Polymericmicelles，ADR-PMs）；3）制备NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（Adriamycin-Polymericmicelles-Nucleophosmin-bindingprotein，ADR-PMs-NPMBP）。其具体包括以下步骤：1）胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸PLA-PEG-OTs）的合成首先合成一端含有对甲苯磺酸酯基团（-OTs）的PEG（HO-PEG-OTs）作为大分子引发剂，加入二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入三乙胺，使PEG完全溶解；称取TsCl及DMAP，使用DCM溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM溶液中；采用开环聚合法合成PLA-PEG-OTs；2）阿霉素胶束（ADR-PMs）的制备称取步骤1）制得的聚合物PLA-PEG-OTs20mg，加入浓度为2mg/mL阿霉素的丙酮溶液2mL，于磁力搅拌器上避光搅拌；待聚合物溶解完全后，缓慢滴加去离子水2mL，搅拌均匀以后，35℃避光减压旋蒸1h除去有机溶剂，得到澄清的阿霉素胶束溶液（ADR-PMs），最后使用0.22μm的滤膜无菌过滤备用。3）NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（ADR-PMs-NPMBP）的制备取步骤2）制得的ADR-PMs溶液，加入适量无菌过滤的pH=7.4的PBS缓冲溶液，再加入NPMBP，总体积为500μL。混合均匀后，得到纳米载药胶束溶液（ADR-PMs-NPMBP）。所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联胶束的制备方法，其特征在于：称取分子量为4000Da的聚乙二醇（PEG）4.6g，加入10mL二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入0.3g三乙胺于冰水浴4℃搅拌30min，使PEG完全溶解；称取4-甲苯磺酰氯（TsCl）0.2g及4-二甲氨基吡啶(DMAP)12.2mg，使用30mLDCM溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM溶液中，滴加完后恢复至室温继续搅拌反应24h；减压蒸馏除去部分溶剂，过滤除去反应生成的盐，滤液于冰乙醚沉淀两次，过滤收集产物，室温真空干燥即得白色粉末状的HO-PEG4000-OTs；然后称取HO-PEG-OTs1g，D,L-丙交酯适量，质量为丙交酯的0.5wt%的异辛酸亚锡（Sn(Oct)2）溶于无水甲苯中，于130℃搅拌反应24h反应结束以后，将反应产物溶于无水DCM中，于冰乙醚中沉淀两次，过滤收集产物，真空干燥即得产物；通过调整加入丙交酯的量以获得不同亲疏水链比的PLA-PEG-OTs。本专利技术上述的方法制得的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束在制备抑制活性或/和治疗癌细胞药物中的应用。所述的癌细胞包括白血病Nalm6。本专利技术的显著优点在于：本专利技术所制得的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的纳米载药胶束合成步骤简单，结构明确，对急性淋巴细胞白血病细胞具有良好的抑制作用。该化合物含有NPM结合蛋白和阿霉素，可靶向抑制癌细胞NPM蛋白的表达，抑制癌细胞RNA和DNA的合成，使得本专利合成的化合物具有良好的抗癌活性和靶向性，具有较高的开发为抗白血病药物的应用前景。附图说明图1为本专利技术的不同处理组NPM蛋白表达的差异（**p<0.01）。具体实施方式为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。实施例1：胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸PLA-PEG-OTs）的合成称取分子量为4000Da的聚乙二醇（PEG）4.6g，加入10mL二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入0.3g三乙胺于冰水浴4℃搅拌30min，使PEG完全溶解，获得含PEG的DCM溶液。称取4-甲苯磺酰氯（TsCl）0.2g及4-二甲氨基吡啶(DMAP)12.2mg，使用30mLDCM溶解后，缓慢滴加到上述含PEG的DCM溶液中，滴加完后恢复至室温继续搅拌反应24h。减压蒸馏除去部分溶剂，过滤除去反应生成的盐，滤液于冰乙醚沉淀两次，过滤收集产物，室温真空干燥即得白色粉末状的HO-PEG4000-OTs。然后称取HO-PEG-OTs1g，D,L-丙交酯0.8g，异辛酸亚锡（Sn(Oct)2）（质量为丙交酯的0.5wt%）溶于无水甲苯中，于130℃搅拌反应24h反应结束以后，将反应产物溶于无水DCM中，于冰乙醚中沉淀两次，过滤收集产物，真空干燥即得产物。实施例2：阿霉素胶束（ADR-PMs）的制备称取上述实施例1制得的PLA-PEG-OTs20mg，加入2mg/mL阿霉素的丙酮溶液2mL，于磁力搅拌器上避光搅拌；待聚合物溶解完全后，缓慢滴加去离子水2mL，搅拌均匀以后，35℃避光减压旋蒸1h除去有机溶剂，得到澄清的阿霉素胶束溶液（ADR-PMs），最后使用0.22μm的滤膜无菌过滤备用。实施例3：NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（ADR-PMs-NPMBP）的制备分别取上述实施例2制得的25μL、50μL、75μL无菌过滤后的ADR-PMs溶液，加入适量无菌过滤的PBS（pH=7.4）缓冲溶液，再分别加入50μLNPM1结合蛋白、100μLNPM1结合蛋白、200μLNPM1结合蛋白，总体积为500μL。混合均匀后，于4℃条件下避光孵育12h，分别得到ADR浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL，NPM1结合蛋白浓度为0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL的阿霉素胶束溶液（ADR-PMs-NPMBP）。实施例4：ADR-PMs-NPMBP对白血病细胞增殖抑制实验将NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束作为受试药物，用培养基将药物稀释。将人急性淋巴细胞白血病细胞株Nalm-6的密度调整为3×105个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置37℃、5%CO2培养箱中培养24h；移去旧的培养基，加入受试药物(浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：步骤如下：1）合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸 PLA-PEG-OTs）；2）制备阿霉素胶束（Adriamycin-Polymeric micelles，ADR-PMs）；3）制备NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（Adriamycin-Polymeric micelles-Nucleophosmin-binding protein，ADR-PMs-NPMBP）。/n
【技术特征摘要】
1.一类具有抗急性淋巴细胞白血病活性的纳米载药胶束的制备方法，其特征在于：步骤如下：1）合成胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸PLA-PEG-OTs）；2）制备阿霉素胶束（Adriamycin-Polymericmicelles，ADR-PMs）；3）制备NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（Adriamycin-Polymericmicelles-Nucleophosmin-bindingprotein，ADR-PMs-NPMBP）。
2.根据权利要求1所述的具有抗急性淋巴细胞白血病活性的NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）胶束（聚乙二醇对甲苯磺酸酯-聚乳酸PLA-PEG-OTs）的合成
首先合成一端含有对甲苯磺酸酯基团（-OTs）的PEG（HO-PEG-OTs）作为大分子引发剂，加入二氯甲烷（Dichloromethane，DCM），并加入三乙胺，使PEG完全溶解；称取TsCl及DMAP，使用DCM溶解后，缓慢滴加到含PEG的DCM溶液中；采用开环聚合法合成PLA-PEG-OTs；
2）阿霉素胶束（ADR-PMs）的制备
称取步骤1）制得的聚合物PLA-PEG-OTs20mg，加入浓度为2mg/mL阿霉素的丙酮溶液2mL，于磁力搅拌器上避光搅拌；待聚合物溶解完全后，缓慢滴加去离子水2mL，搅拌均匀以后，35℃避光减压旋蒸1h除去有机溶剂，得到澄清的阿霉素胶束溶液（ADR-PMs），最后使用0.22μm的滤膜无菌过滤备用；
3）NPM1结合蛋白偶联阿霉素胶束（ADR-PMs-NPMBP）的制备
【专利技术属性】
技术研发人员：胡建达，陈英玉，甘东辉，陈海军，叶富，
申请(专利权)人：福建医科大学附属协和医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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