一种引物组合物及其应用制造技术

本申请提供了一种引物组合物及其应用，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。采用本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增决明及其混伪品的特征序列，从而实现决明及其混伪品的准确鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物及其应用
本专利技术涉及决明及其混伪品的鉴定
，特别是涉及一种引物组合物及其在鉴定决明及其混伪品中的应用。
技术介绍
决明是一种常见的植物药，决明子为豆科植物决明CassiaobtusifoliaL.或小决明CassiatoraL.的干燥成熟种子，田菁Sesbaniacannabina与望江南Cassiaoccidentalis的种子为决明子常见混伪品。混伪品的存在在一定程度上影响了临床用药的安全性，但现有鉴定混伪品的方法，如来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定等，会受到主观因素的影响，无法完全满足目前中药鉴定的需求。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定方法。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对决明及其混伪品特征序列的特异性扩增，实现决明及其混伪品的准确鉴定。本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQIDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO:2所示。本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQIDNo.3所示，望江南的特征序列如SEQIDNo.4所示，田菁的特征序列如SEQIDNo.5所示。本申请第四方面提供了一种用于鉴定决明及其混伪品的试剂盒，包括本申请第一方面所提供的引物组合物。本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增决明及其混伪品的特征序列，从而实现决明及其混伪品的准确鉴定。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1显示了各样品扩增结果的序列相对丰度热图。图2A显示了在3个待测样品中望江南的含量与counts数的相关性；图2B显示了在3个待测样品中决明的含量与counts数的相关性。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物为5’-GTGAATACGAATCTATCT-3’(SEQIDNO:1)；所述反向引物为5’-GGATTTTCCTTGATATCT-3’(SEQIDNO:2)。本申请第二方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。专利技术人在研究中发现，本申请的引物组合物，能够同时用于扩增决明、望江南以及田菁的具有不同碱基序列的DNA片段，因此，如果决明药材中混有望江南和/或田菁，对药材的总DNA进行PCR扩增的产物中就会出现望江南和/或田菁的DNA片段；以决明、望江南和田菁的具有不同碱基序列的DNA片段作为各自的特征序列，通过鉴定扩增结果中是否存在决明、望江南及田菁的特征序列，即可确定决明药材中是否含有望江南和/或田菁。其中，决明的特征序列为：5’-TTCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTAGAGTCCTTTTTGAGCGAATTTATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAAGATTTTCGGTCCACCCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGTT-3’(SEQIDNo.3)；望江南的特征序列为：5’-TTCTTTTTCTCCGTAACAAATCTTCTTATTTACGATTAACATCTTCTGGAATCCTTTTTGAGCGAATCAATTTCTATGCAAAAATAGAACATTTTGTAGAAGTCTTTGATAAAGATTTTCCGTCCACTCTATGGTTCTTCAAGGACCCTTTCATTCATTATGCT-3’(SEQIDNo.4)；田菁的特征序列为：5’-TCCTTTTTCTACGTAACAAATCTTCTCATTTACGATTAAAATCTTTTAGTGTTTTTTTTGAACGAAGTTTTTTCTATGCAAAACGAGAGAATCTTGTAGAATTCTTTGCTAAAGATTTTTCGTCTATCTTAACATTCTTCAAGGATCCTTTCATTCATTATGTT-3’(SEQIDNo.5)。本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQIDNo.3所示，望江南的特征序列如SEQIDNo.4所示，田菁的特征序列如SEQIDNo.5所示。本申请中，对待测样品总DNA的提取方法不做限定，只要能够实现本专利技术的目的即可，例如可以采用市售的植物基因组提取试剂盒即可，如TIANGEN公司的植物基因组提取试剂盒。对待测样品的总DNA进行PCR扩增可采用常规的PCR扩增体系，例如25μL扩增体系或50μL扩增体系等，本申请在此不做限定。在本申请第三方面的一些实施方式中，PCR扩增体系中包括：0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/L反向引物；2-10ng/μL模板DNA；50-150μmol/LdNTPs；0.02-0.03U/μLDNA聚合酶。dNTPs以及DNA聚合酶均为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得。DNA聚合酶可以选择PCR扩增用的常规DNA聚合酶，本申请在此不做限定，例如GflexDNA聚合酶。当然，所述PCR扩增体系中还包括PCR缓冲液和ddH2O，所述PCR缓冲液根据所用的DNA聚合酶的种类确定，可市售获得。通常PCR缓冲液与DNA聚合酶需要配合使用，市售DNA聚合酶均配有与之配合使用的PCR缓冲液，此为本领域常规操作，本申本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ IDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQIDNO:1所示，所述反向引物的序列如SEQIDNO:2所示。


2.权利要求1所述的引物组合物在鉴定决明及其混伪品中的用途；所述混伪品包括望江南或田菁中的至少一种。


3.一种采用权利要求1的引物组合物鉴定决明及其混伪品的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品的总DNA；
2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
3)对扩增产物进行二代测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
4)将步骤3)获得的基因序列与决明及其混伪品的特征序列进行比对，鉴定决明及其混伪品；其中，决明的特征序列如SEQIDNo.3所示，望江南的特征序列如SEQIDNo.4所示，田菁的特征序列如SEQIDNo.5所示。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中包括：
0.1-0.3μmol/L正向引物；0.1-0.3μmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓轩，陈璐，谭伟，王丹，崔英，苗琳，刘梦扬，王彧，于海洋，董鹏志，邵瑞，崔元璐，张晗，毛浩萍，李越，李霖，吴昱铮，柴丽娟，李晋，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12