一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取供试小麦品种的DNA；(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括18对KASP荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1‑36所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.37‑54所示；(3)基于扩增过程中产物的荧光信号强弱，对目标产物进行分型检测。本发明专利技术的指纹图谱中，包括18对小麦已被成功克隆的重要基因组成的KASP功能标记组合，利用PCR扩增技术、KASP基因分型技术，基于控制小麦中适应性性状和抗性性状的一些重要功能基因开发的标记，对小麦品种进行功能基因指纹图谱构建，具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法及其应用
本专利技术涉及小麦育种及应用
，尤其涉及一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法及其应用。
技术介绍
小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一，现已成为世界三大主要粮食作物之一。全世界43个国家，有35％-40％的人口以小麦为主要粮食。小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素B，是一种营养丰富、经济价值较高的商品粮。因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。品种鉴定对于品种权保护和产权纠纷具有重要作用，随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。分子标记技术具有周期短、不受环境条件影响、可进行高通量测试分析等优点，已经在品种鉴定、种子纯度鉴定等方面得到广泛应用。但是，传统AFLP、SSR等指纹图谱存在标记数量有限、检测位点少、位点突变率高等缺点。而目前的小麦指纹图谱均是基于SSR标记构建，SSR标记是随机扩增，找到多态性位点，并没有明确的目的性，更没有针对目标基因内部进行精确的评价，不能满足现在的育种需求。为了弥补SSR分子标记的不足，基于基因开发的功能标记应运而生。功能标记来源于控制表型的基因序列内部，在鉴别基因序列的表型功能后，挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应，从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的DNA标记，即功能标记。功能标记(functionalmarker)是依据基因序列的多态性开发的，这些基因的不同等位变异与表型直接相关。本专利技术基于功能标记对小麦品种构建指纹图谱。
技术实现思路
为了克服SSR标记并无针对基因构建图谱的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，运用小麦中被鉴定的控制重要农艺性状的KASP功能标记，构建了首个功能基因的指纹图谱，弥补了只针对单个性状或者基因对小麦鉴定的片面性，为今后育种家对小麦资源的评价和利用提供了科学的理论支撑。本专利技术的目的之二在于提供一种小麦KASP功能基因指纹图谱。本专利技术的目的之三在于提供一种小麦KASP功能基因指纹图谱的应用。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取供试小麦品种的DNA；(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括18对KASP荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQIDNO.1-36所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQIDNO.37-54所示；(3)基于扩增过程中产物的荧光信号强弱，对目标产物进行分型检测。进一步地，所述小麦KASP功能基因包括小麦适应性相关基因：控制株高的基因Rht-B1和Rht-D1，影响小麦春化的基因Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1，影响小麦开花的光周期基因Ppd-D1；小麦抗性相关基因：抗穗发芽的基因4个，分别是PHS1、Sdr-B1、VP-1B和MFT-A1，抗干旱的基因为1-fehw3和Dreb-B1；抗叶锈的基因Lr14a、Lr34和Lr68；抗条锈的基因Yr15、抗赤霉病的基因Fhb1以及1BL/1RS易位系。为选育适应性强的高产品种，育种家对作物不断的改良选择，以“绿色革命”为代表的矮杆小麦推动了20世纪40年代之后产量的极大提升；而春化和开花是小麦生命周期中两个重要的生长阶段，对这两个性状的改良使得小麦的适应性不断增强。本专利技术中所涉及的正是这三个性状，其中控制株高的基因为Rht-B1和Rht-D1；影响小麦春化的基因为Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1；影响小麦开花的基因为光周期基因Ppd-D1。生物胁迫和非生物胁迫是影响作物稳产的主要因素。随着全球气候变化以及病原菌快速变异，育种家对抗性性状及相关基因的选择从未停止。本专利技术涉及到的表型性状包括穗发芽、抗旱、抗赤霉病、抗叶锈病、抗条锈病，其中抗穗发芽的基因4个，分别是PHS1、Sdr-B1、VP-1B和MFT-A1；抗干旱的基因为1-fehw3和Dreb-B1；抗叶锈的基因Lr14a、Lr34和Lr68；抗条锈的基因Yr15、抗赤霉病的基因Fhb1以及1BL/1RS易位系。进一步地，上述步骤(1)中DNA的提取过程如下：A：配置CTAB缓冲液，放入65℃水浴锅中预热；B：取适量小麦组织经液氮冷却后打碎，加入上述步骤A中预热后的CTAB缓冲液，混合均匀后水浴加热；C：将上述步骤B的混合物冷却至室温，加入氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心，取上清液，加入RNaseA，混匀，室温放置一段时间；D：向上述步骤C的混合物中加入预冷的异丙醇，混合均匀后，静置沉淀，离心后取沉淀加入乙醇溶液洗涤，干燥后即得待测的DNA样品。进一步地，上述步骤A中CTAB缓冲液的配置过程如下：每升CTAB缓冲液加入20gCTAB，200mLpH＝8.0的1.0MTris-HCl缓冲液，81gNaCl，40mL0.5MEDTA，10g1％PVP。进一步地，上述步骤C中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；上述步骤D中加入0.7倍混合物体积在-20℃预冷的异丙醇。进一步地，PCR扩增反应体系包括：浓度为40ng/μL待测DNA样品2.2μL，KASPLowMixture2.5μL，Mg2+0.04μL，引物溶液0.056μL，ddH2O0.204μL；KASP扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存。进一步地，上述步骤(2)中PCR扩增中引物溶液的组成为：在体积为100μL的溶液中包括浓度为100μM的两条正向引物各12μL，通用反向引物30μL，ddH2O46μL。进一步地，上述步骤(3)中待PCR反应完成后，收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测，同一位点不同等位变异呈现不同颜色，相同等位变异类型的材料以相同颜色的点通过二维聚类图展示，统计小麦品种在18个基因位点的等位变异情况，计算位点的遗传多样性；进一步将每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，构建小麦的指纹图谱。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种小麦KASP功能基因指纹图谱，由上述方法构建得到。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：上述小麦KASP功能基因指纹图谱在小麦品种鉴定方面的应用。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法中，包括18对小麦基因组KASP标记组成的功能组合，利用PCR扩增技术、KASP基因分型技术对小麦品种进行鉴定，可在短时间内完成小麦资源功能基因品种鉴定与遗传多样性评价工作，具有省时、高通量、快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点；与传统基于SSR标记构建的指纹图谱相比，本专利技术是基于控制小麦本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取供试小麦品种的DNA；/n(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括18对KASP荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1-36所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.37-54所示；/n(3)基于扩增过程中产物的荧光信号强弱，对目标产物进行分型检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取供试小麦品种的DNA；
(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括18对KASP荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQIDNO.1-36所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQIDNO.37-54所示；
(3)基于扩增过程中产物的荧光信号强弱，对目标产物进行分型检测。


2.根据权利要求1所述一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述小麦KASP功能基因包括小麦适应性相关基因：控制株高的基因Rht-B1和Rht-D1，影响小麦春化的基因Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1；影响小麦开花的光周期基因Ppd-D1；小麦抗性相关基因：抗穗发芽基因4个，分别是PHS1、Sdr-B1、VP-1B和MFT-A1，抗干旱的基因为1-fehw3和Dreb-B1；抗叶锈的基因Lr14a、Lr34和Lr68；抗条锈的基因Yr15、抗赤霉病的基因Fhb1以及1BL/1RS易位系。


3.根据权利要求1所述一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中DNA的提取过程如下：
A：配置CTAB缓冲液，放入65℃水浴锅中预热；
B：取适量小麦组织经液氮冷却后打碎，加入上述步骤A中预热后的CTAB缓冲液，混合均匀后水浴加热；
C：将上述步骤B的混合物冷却至室温，加入氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心，取上清液，加入RNaseA，混匀，室温放置一段时间；
D：向上述步骤C的混合物中加入预冷的异丙醇，混合均匀后，静置沉淀，离心后取沉淀加入乙醇溶液洗涤，干燥后即得待测的DNA样品。


4.根据权利要求3所述一种小麦KASP功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤A中CTAB缓冲液的配置过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：王倩，胡欢，刘建国，安家兴，任群利，王苗，李小兰，汪蓓蕾，邓飞龙，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52