一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法技术

本发明专利技术涉及一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。采用本发明专利技术的检测方法可以消除注射用达托霉素中间产品的抑菌性，确保检验结果的准确性，用于注射用达托霉素中间产品的微生物计数检查。

【技术实现步骤摘要】
一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法
本专利技术属于药物分析
，具体涉及一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法。
技术介绍
微生物计数检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数(TAMC)、霉菌及酵母菌总数(TYMC)及控制菌检查。无菌制剂中间产品的微生物计数检查是对原辅料、内包材、投料过程、药液配制罐、药液管道、生产用工器具、过滤系统、灌装环境保证等方面进行的控制，因此，无菌制剂中间产品的微生物计数水平同样需要监控，主要检测项目为需氧菌总数(TAMC)、霉菌及酵母菌总数(TYMC)。目前，微生物计数检查主要有三种方法，分别为：平皿法、薄膜过滤法和MPN法。平皿法操作简单，对于消除产品抑菌性较差。薄膜过滤法，操作相对复杂，对于消除产品自身的抑菌性能力较强。MPN法的操作复杂度不高，但是精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法。注射用达托霉素，适应症为金黄色葡萄球菌(包括甲氧西林敏感和甲氧西林耐药)导致的伴发右侧感染性心内膜炎的血流感染(菌血症)。注射用达托霉素中间产品的成分主要见下表：配方功能处方量1mL用量达托霉素活性物质500mg/支81.5040mg/mL氢氧化钠pH调节剂Q.S.Q.S.topH注射用水溶剂Q.S.Q.S.当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试品溶液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下。①增加稀释液或培养基体积；②加入适宜的中和剂或灭活剂；③采用薄膜过滤法；④上述几种方法的联合使用。若没有适宜的消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法。本专利技术的技术方案如下：一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品，即符合药典要求的注射用达托霉素注射液。本专利技术以注射用达托霉素中间产品作为供试品溶液，采用薄膜过滤法，选择合适的中和剂加入培养基中进行微生物计数检查，具体包括以下步骤：(1)润湿滤膜：以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；(2)需氧菌总数的测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；(3)霉菌和酵母菌总数测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。达托霉素是一种钙离子依赖性抗生素，在无钙离子的条件下几乎不具有抗菌活性。而pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中均含有微量的钙离子。本专利技术在需氧菌总数的测定时，为了消除供试品溶液的抑菌活性，在所用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，以螯合培养基中的钙离子。在本专利技术中，冲洗液的种类很重要，需要严格控制，例如，使用常用的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和0.1％蛋白胨水溶液都不易排除干扰作用，影响检测微生物计数检验的回收率。本专利技术以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，可以排除干扰作用，从而使注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率符合规定。在一种优选方案中，冲洗液为含体积浓度为0.5％～2％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种更优选方案中，冲洗液为含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。在一种方案中，本专利技术提及的含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液按照如下方法制备：(1)称取34g磷酸二氢钾和7g氢氧化钠于1000mL三角瓶中，加入纯化水溶解至1000mL，制备pH7.2磷酸盐储备缓冲液；(2)将纯化水和pH7.2磷酸盐储备缓冲液以体积比800:1混匀后灭菌，制备pH7.2磷酸盐缓冲液；(3)将pH7.2磷酸盐缓冲液和吐温80以体积比99:1混匀后灭菌，即得含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。对于本专利技术而言，在需氧菌总数的测定时，冲洗液的选择和胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)在制备过程中添加EDTA-2Na的浓度，均影响本申请检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率。当EDTA-2Na的浓度较低时，不能够消除样品中抑菌作用，使试验菌的回收率不符合规定；当EDTA-2Na的浓度较高时，破坏了样品中微生物的生存条件，同样使试验菌的回收率不符合规定。针对本专利技术，在需氧菌总数的测定时，所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液，能够消除样品中抑菌作用，使试验菌的回收率不符合规定。在一种优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L～0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液，注射用达托霉素中间产品中微生物计数的回收率符合规定，且更加稳定。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种更优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加0.05mol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液。在一种优选方案中，本专利技术在需氧菌总数的测定时，所使用的胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的0.1％～0.2％。在一种更优选方案中，在胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)中添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)无菌溶液的体积为胰酪大豆胨琼脂培养基总体积的的0.13％～0.14％。例如，具体可以为0.13％、0.132％、0.134％、0.137％、0.138％、0.139％或0.14％。采用本专利技术的方法检测注射用达托霉素中间产品中微生物的数量时，还可以包括阴性对照，它包括以下步骤：(1)润湿滤膜：以含体积浓度为1％吐温80的pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，其特征在于，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。/n

【技术特征摘要】
1.一种薄膜过滤法检测注射用达托霉素中间产品中微生物计数的方法，其特征在于，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液作为冲洗液，在添加有0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基中培养需氧菌，在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养霉菌及酵母菌，采用薄膜过滤法分别检测供试品溶液中需氧菌总数和霉菌及酵母菌的总数，所述供试品溶液为已添加各种辅料制成的注射用达托霉素中间产品。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)润湿滤膜：以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液润湿滤膜；
(2)需氧菌总数的测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于含0.05mol/L～0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的胰酪大豆胨琼脂培养基上，在30～35℃培养3～5天后进行检测；
(3)霉菌和酵母菌总数测定：供试品溶液经润湿的滤膜过滤后，以含吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗滤膜，将冲洗后的滤膜的菌面朝上，贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，在20～25℃培养5～7天后进行检测。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冲洗液为含体积浓度为0.5％～2％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冲洗液为含体积浓度为1％吐温80的pH7.2磷酸盐缓冲液。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二钠无菌溶液的浓度为0.05mol/L～0.1mol/L。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乙二胺四乙酸二...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐咏群，曹宇，
申请(专利权)人：南京健友生化制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32