食蚊鱼Nrf2基因及其提取方法及特异性一抗抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种食蚊鱼Nrf2基因及其提取方法及特异性一抗抗体制备方法，首次成功克隆了食蚊鱼体内的Nrf2基因的核心碱基序列，并合成了食蚊鱼Nrf2特异性多克隆一抗抗体，可推广用于快速获得其他非模式物种未知碱基序列及制备相关特异性抗体，并在后续研究中使用这些基因构建分子层面检测方法和使用抗体从事相关蛋白变化的检测。食蚊鱼环境适应力超强，甚至在生物需氧量和化学需氧量较高的污水和下水道中都能正常生活，推测其超强生命力也和其体内的Nrf2抗氧化信号通路有关，本方法克隆出的基因和制备出的一抗抗体可为研究Nrf2相关通路如何在环境压力下发挥抗氧化作用、生物如何抵御氧化应激压力和相关环境风险提供新的技术手段和检测方法。

【技术实现步骤摘要】
食蚊鱼Nrf2基因及其提取方法及特异性一抗抗体制备方法
本专利技术涉及基因提取及特异性抗体制备
，具体涉及一种食蚊鱼Nrf2基因及其提取方法及特异性一抗抗体制备方法。
技术介绍
食蚊鱼(Gambusiaaffinis)是一种小型淡水鱼，原产于南美洲，归属于胎鳉科食蚊鱼属。雌鱼和雄鱼体型明显区别：雌鱼体型普遍大于雄鱼，雌鱼臀鳍呈扇形，雄鱼臀鳍呈剑型。食蚊鱼又名大肚鱼、柳条鱼，其繁殖方式为卵胎生。食蚊鱼因其极强的环境适应性和广谱的食性，而在全球各地被广泛引进用以控制蚊虫相关的疫情。近些年来，食蚊鱼作为入侵种，已广泛存在于中国的河流水域中。由于其性别差异明显、在自然水域广泛分布、容易捕获以及易于实验室驯养，食蚊鱼适合作为生态环境研究方面的实验动物。目前已有一些以食蚊鱼作为实验动物的研究和报道。但由于食蚊鱼非模式实验动物，也不是珍稀保护物种，对于我国来说甚至属于入侵物种，其强大的环境适应力和繁殖力，甚至侵占了很多中国本地生态位相近的物种(如青鳉)的生存空间，大多数科研人员对其研究还停留在浅表层面。此外，食蚊鱼遗传背景不清晰，NCBI数据库中没有收录其全基因组的序列。相关研究多集中于食蚊鱼的表观性状变化和种群结构等方面，深入探讨其基因的分子生物学层面相关研究和方法还很少。Nrf2核转录因子(NF-E2-relatedfactor2)，又称NFE2L2，是一种含有碱性亮氨酸拉链结构的核转录因子。Nrf2是生物体内一种非常重要，进化上非常保守的调控生物体氧化应激响应转录因子，一般通过Nrf2/ARE(Antioxidantresponseelement)信号通路，调控下游抗氧化相关基因和Ⅱ相解毒代谢酶基因的表达，维持和保护机体内氧化还原状态的平衡。有鉴于此，急需对现有的基因提取方法进行改进，以方便操作，并获得食蚊鱼的Nrf2基因及特异性一抗抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是食蚊鱼遗传背景不清晰，NCBI数据库中没有收录其全基因组的序列的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是提供一种食蚊鱼Nrf2基因，其特征在于，该基因片段序列如Nrf2IDNO.1所示。本专利技术所采用的另一技术方案是一种食蚊鱼Nrf2基因提取方法，包括以下步骤：1)提取食蚊鱼肝脏总RNA；2)根据食蚊鱼肝脏总RNA，反转录获得食蚊鱼第一链cDNA；3)以食蚊鱼第一链cDNA为模板，进行普通PCR扩增以获得食蚊鱼Nrf2核心片段；4)将已完成PCR扩增的产物与5×LoadingBuffer按混匀后，注入凝胶上的点样孔中，并加点合适的Marker，电泳仪电压90V运行40min；5)将电泳结束后的凝胶用ChemiDocXRS+凝胶成像系统紫外光检测电泳结果，将符合设计长度的条带位置的凝胶切下，并进行测序。在上述技术方案中，所述提取食蚊鱼肝脏总RNA包括：1)RAN提取：将食蚊鱼的肝脏放入无菌处理过的圆底离心管内，并加入TrizolReagent溶液，用0一次性无菌注射器抽吸吹打，至溶液为均匀粉红色匀浆，用针头吸取溶液无堵塞情况，无明显块状物；将均匀粉红色匀浆在圆底离心管室温静置5min；加入200μL氯仿，盖好离心管盖后，摇离心管混匀，室温静置5min；再将圆底离心管在4℃，12000g下离心15min；2)RNA沉淀：吸取上清液到无菌尖底离心管，加入异丙醇，盖好管盖轻轻上下颠倒几次，于室温静置10min，尖底离心管在4℃，12000g下离心10min，离心后管底会形成白色凝胶样沉淀；3)RNA净化：尖底离心管弃去上清，加入75％无菌处理乙醇，用手指轻弹管底，使沉淀悬浮；尖底离心管在4℃，7500g下离心5min，用移液枪小心吸走上清；在室温状态下干燥5～10min，使乙醇挥发；加入RNaseFreeH2O，溶解RNA。在上述技术方案中，在进行普通PCR扩增以获得食蚊鱼Nrf2核心片段时，普通PCR的反应体系为ddH2O17.25μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMixture2μL，cDNA模板0.75μL，上下游引物(10μM浓度)各1μL，rTaq酶0.5μL，反应总体系为25μL。普通PCR反应在ABIVeriti96孔梯度PCR仪进行，反应条件为95℃，预变性4min；94℃，变性30s，55℃，退火40s，72℃，延伸1min，循环35次；72℃，延伸10min；4℃保存。在上述技术方案中，所述引物需根据NCBI数据库和EnsemblASIA数据库现有数据，选择与食蚊鱼亲缘关系近的鱼类的基因序列为参考，并寻找与食蚊鱼亲缘关系近的几个物种之间的保守区域，并在保守区域中根据普通PCR引物设计要求设计引物。在上述技术方案中，在进行电泳时需要加入缓冲液及2％琼脂糖凝胶。本专利技术提供的另一种个技术方案是一种食蚊鱼Nrf2基因特异性一抗抗体制备方法，根据上述食蚊鱼Nrf2序列，分析出敏感性多肽链，合成食蚊鱼Nrf2蛋白特异性多克隆一抗抗体。在上述技术方案中，食蚊鱼Nrf2基因特异性一抗抗体制备方法具体包括以下步骤：1)分别合成第606至617个碱基对应的NRF2多肽和第41至52个碱基对应的NRF2多肽；2)将合成的第606至617个碱基对应的NRF2多肽和第41至52个碱基对应的NRF2多肽分别进行KLH偶联后，混合免疫2只新西兰白兔，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫4次；3)进行抗血清效价检测；4)进行抗体的纯化和鉴定。在上述技术方案中，所述抗血清间接效价检测的步骤具体为：1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；2)包被：用PBS包被液将第606至617个碱基对应的NRF2多肽和第41至52个碱基对应的NRF2多肽抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜；包被抗原：第606至617个碱基对应的NRF2多肽、第41至52个碱基对应的NRF2多肽；包被浓度：5μg/ml,100ul/孔；包被缓冲液：磷酸盐缓冲液；3)封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱1h，取出酶标板，弃去内液，洗板1次；4)一抗反应：抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100μL，37℃恒温箱1h；5)二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗兔-HRP，1/5000，37℃恒温箱1小时；6)显色：取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μLTMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min；7)终止反应：每孔加入100μL1MHCL溶液，终止反应，即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。在上述技术方案中，所述进行抗体的纯化包括以下步骤：将巯基胶与第606至617个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食蚊鱼Nrf2基因，其特征在于，该基因片段序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种食蚊鱼Nrf2基因，其特征在于，该基因片段序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种如权利要求1所述的食蚊鱼Nrf2基因提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取食蚊鱼肝脏总RNA；
2)根据食蚊鱼肝脏总RNA，反转录获得食蚊鱼第一链cDNA；
3)以食蚊鱼第一链cDNA为模板，进行普通PCR扩增以获得食蚊鱼Nrf2核心片段；
4)将已完成PCR扩增的产物与5×LoadingBuffer按混匀后，注入凝胶上的点样孔中，并加入Marker，电泳仪电压90V运行40min；
5)将电泳结束后的凝胶用ChemiDocXRS+凝胶成像系统紫外光检测电泳结果，将符合设计长度的条带位置的凝胶切下，并进行测序。


3.根据权利要求2所述的一种食蚊鱼Nrf2基因提取方法，其特征在于，所述提取食蚊鱼肝脏总RNA包括以下步骤：
1)RAN提取：将食蚊鱼的肝脏放入无菌处理过的圆底离心管内，并加入TrizolReagent溶液，用0一次性无菌注射器抽吸吹打，至溶液为均匀粉红色匀浆，用针头吸取溶液无堵塞情况，无明显块状物；将均匀粉红色匀浆在圆底离心管室温静置5min；加入200μL氯仿，盖好离心管盖后，摇离心管混匀，室温静置5min；再将圆底离心管在4℃，12000g下离心15min；
2)RNA沉淀：吸取上清液到无菌尖底离心管，加入异丙醇，盖好管盖轻轻上下颠倒几次，于室温静置10min，尖底离心管在4℃，12000g下离心10min，离心后管底会形成白色凝胶样沉淀；
3)RNA净化：尖底离心管弃去上清，加入75％无菌处理乙醇，用手指轻弹管底，使沉淀悬浮；尖底离心管在4℃，7500g下离心5min，用移液枪小心吸走上清；在室温状态下干燥5～10min，使乙醇挥发；加入RNaseFreeH2O，溶解RNA。


4.根据权利要求2所述的一种食蚊鱼Nrf2基因提取方法，其特征在于，在进行普通PCR扩增以获得食蚊鱼Nrf2核心片段时，普通PCR的反应体系为ddH2O17.25μL，10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMixture2μL，cDNA模板0.75μL，上下游引物各1μL，rTaq酶0.5μL，反应总体系为25μL，普通PCR反应在ABIVeriti96孔梯度PCR仪进行，反应条件为95℃，预变性4min；94℃，变性30s，55℃，退火40s，72℃，延伸1min，循环35次；72℃，延伸10min；4℃保存。


5.根据权利要求4所述的一种食蚊鱼Nrf2基因提取方法，其特征在于，所述引物需根据NCBI数据库和EnsemblASIA数据库现有数据，选择与食蚊鱼亲缘关系近的鱼类的基因序列为参考，并寻找与食蚊鱼亲缘关系近的几个物种之间的保守区域，并在保守区域中根据普通PCR引物设计要求设计引物。


6.根据权利要求1所述的一种食蚊鱼Nrf2基因提取方法，其特征在于，在进行电泳时需要加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍爽，聂湘平，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44