利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法技术

本发明专利技术公开了利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，是利用转录组学手段，测定苜蓿品种接种不同根瘤菌株后的差异基因，并通过差异基因数量权重，鉴定苜蓿品种与根瘤菌株的结瘤专一性。本发明专利技术利用转录组学技术直接鉴定苜蓿品种与根瘤菌株的结瘤专一性，摆脱了对共生表型指标的依赖，避免由表型指标引起的共生效应评价不精准的问题，提高了共生效应鉴定的精准性和促进生长的高效性，结果稳定可靠，易于应用，对苜蓿与根瘤菌的精准共生具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法
本专利技术属于农业领域，具体涉及利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法。
技术介绍
豆科植物与根瘤菌的共生固氮体系是自然界效率最高的固氮体系。农业生产中所栽培的豆科植物品种繁多，而不同豆科植物品种与根瘤菌株间存在共生匹配专一性，即某一根瘤菌株仅能与特定豆科植物基因型高效结瘤固氮。苜蓿品种与根瘤菌株的促生效应具有明显的对苜蓿品种和根瘤菌株专一性共生的依赖性，不同根瘤菌株与苜蓿品种共生根瘤对植株生长产生的增产效应差异明显。因此，快速、精准的鉴定共生专一性，以实现根瘤菌株与苜蓿品种的高效匹配，是提高共生系统促进生长效应的重要途径。目前，对于苜蓿-根瘤菌共生专一性效应的鉴定缺乏精准和快速简便的方法。通常采用田间苜蓿品种接种根瘤菌株，测定共生表型指标的方法筛选高效的共生组合，且在共生表型指标的选择和测定方法上缺乏统一规范和标准，存在受环境条件影响大、结果可靠性低等问题；同时，虽然占瘤率、結瘤数量、固氮酶活性、固氮量、株高和生物量等指标被大多数人所采用，但是由它们衡量的共生效应往往与实际结果存在不一致性，缺乏有效的指导意义。在分子技术应用方面，有关根瘤菌共生效应的研究，主要集中在结瘤因子与固氮酶合成及调控关键基因等方面，但尚未应用到苜蓿-根瘤菌的专一性效应方面。而转录组学技术已经被用于研究紫花苜蓿与根瘤菌的互作，不仅可以用于寻找差异基因和精确分析苜蓿品种与根瘤菌株专一性高效共生的分子机理，还可以利用转录组学技术鉴定苜蓿品种与根瘤菌株的专一性共生效应，可以从基因簇、注释蛋白和代谢通路等角度更加直观的体现苜蓿品种和根瘤菌株共生互作的有效性，为精准构建苜蓿与根瘤菌高效共生体、提高苜蓿产量和质量提供路径。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，有效的解决了上述
技术介绍
中存在的问题。本专利技术采用的技术方案如下：利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，包括以下步骤：S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；S2、制备根瘤菌液，将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；S3、接种根瘤菌株，将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；S4、样品采集，将收获的紫花苜蓿植株处理后随机选取若干株，采集紫花苜蓿植株的毛根处理后保存；S5、总RNA提取，采用总RNA提取试剂盒根据Trizol法提取紫花苜蓿植株的毛根组织总RNA；S6、对总RNA的质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性；S7、cDNA文库构建及上机检测，以提取和检测的总RNA样品为材料，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；S8、转录本Denovo组装和基本注释，对检测数据处理得到高质量的cleanreads，并进行转录本Denovo拼接组装和基本注释；S9、对cleanreads进行基因差异表达分析；S10、通过基因差异表达分析，实现对专一性共生结瘤效应确定。所述S4中，收获的紫花苜蓿植株处理方式和紫花苜蓿植株的毛根处理方式为：根瘤菌液接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分，随机选取，采集苜蓿植株的毛根并混匀，用锡箔纸包裹，并在泡沫盒内迅速用液氮冷冻，保存备用。所述S4中，样品的采集部位包括毛根和根瘤。所述S5还包括：S501、向毛根组织和根瘤的混合物中加入液氮，迅速研磨至粉末，加入SL和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀并离心处理；S502、将上清液转至过滤柱CS中，离心处理，转移上清液至新的RNase-Free离心管中；S503、加入无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；S504、将去蛋白液RW1加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；S505、将DNaseI储存液加入新的RNase-Free离心管中，再加入RDD溶液，轻柔混匀；S506、将DNaseI工作液加入吸附柱CR3中央，室温静置；S507、将去蛋白液RW1加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；S508、将漂洗液RW加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液，重复处理；S509、将S508中的CR3吸附柱离心处理后，转移至新的RNase-Free离心管中，将RNase-FreeddH2O悬空滴入吸附膜中部，室温静置，并离心处理，收集RNA溶液；S5010、取适量RNA进行浓度测定并进行琼脂糖电泳检测，并保存。所述S6总RNA的质量检测包括采用Nanodrop超微量紫外分光光度计和2％琼脂糖凝胶电泳定量检测RNA条带，再利用Agilent2100生物分析仪进行RNA样品质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性，其余保存备用。所述S7中，cDNA文库构建及上机检测包括：S701、以短片段mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链；S702、利用dNTPs、缓冲液、DNApolymeraseI和RNaseH合成第二条cDNA链；S703、通过QiaQuickPCR试剂盒纯化、EB缓冲液洗脱、末端修复、加poly(A)和连接测序接头；S704、采用琼脂糖凝胶电泳选择长度为150～200bp的片段；S705、采用Phusion高保真度DNA聚合酶、通用PCR引物和index(X)引物进行PCR扩增，并用Agilent2100生物分析仪检测扩增产物质量；建好的cDNA测序文库用IlluminaNovaSeq6000平台进行测序。所述S8中，转录本Denovo组装和基本注释包括：S801、利用FastQC(v0.11.5)对测序得到的原始数据进行质控，滤去含adapter、N比例>10％以及低质量的reads，获得高质量的cleanreads；S802、通过碱基组成、质量值分布图和饱和度分析检测数据质量情况；S803、使用Trinity(v2.2.0)组装软件对过滤后的高质量cleanreads进行转录本denovo拼接组装，后进行转录本聚类，取最长转录本为Unigene，最后通过N50数值和序列长度来评估组装结果质量；S804、采用Blast+(v2.4.0)将转录本注释到Nr、COG/KOG和KEGG数据库；S805、利用Blast2Go(v2.3.5)软件进行GO注释。所述S9中，基因差异表达分析包括采用EdgeR软件(v3.14.0)进行差异基因分析，基因的表达量用FPKM值表示。错误发现率≤0.05且|log2FC|>1为筛选差异基因的条件，以表达差异倍数≥2或≤0.5表示表达上调或下调，在转录组比较组合中选取差异基因；通过比对GO数据库对差异基因进行功能注释和显著性富集分析；通过比对KEGG数据库，对差异基因参与的细胞代谢途径及其产物功能进行系统分析。所述S10中，专一性共生结瘤效应确定方式为：多个根瘤菌株接种于同一个苜蓿品种，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；/nS2、制备根瘤菌液，将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；/nS3、接种根瘤菌株，将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；/nS4、样品采集，将收获的紫花苜蓿植株处理后随机选取若干株，采集紫花苜蓿植株的毛根处理后保存；/nS5、总RNA提取，采用总RNA提取试剂盒根据Trizol法提取紫花苜蓿植株的毛根组织总RNA；/nS6、对总RNA的质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性；/nS7、cDNA文库构建及上机检测，以提取和检测的总RNA样品为材料，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；/nS8、转录本De novo组装和基本注释，对检测数据处理得到高质量的clean reads，并进行转录本De novo拼接组装和基本注释；/nS9、对clean reads进行基因差异表达分析；/nS10、通过基因差异表达分析，实现对专一性共生结瘤效应确定。/n

【技术特征摘要】
1.利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、挑选健康紫花苜蓿品种种子数粒，经处理后种植培养至发芽，形成紫花苜蓿幼苗；
S2、制备根瘤菌液，将根瘤菌株经培养处理后调制成根瘤菌液；
S3、接种根瘤菌株，将制备的根瘤菌液加入紫花苜蓿幼苗根部；
S4、样品采集，将收获的紫花苜蓿植株处理后随机选取若干株，采集紫花苜蓿植株的毛根处理后保存；
S5、总RNA提取，采用总RNA提取试剂盒根据Trizol法提取紫花苜蓿植株的毛根组织总RNA；
S6、对总RNA的质量检测，综合评估样品的浓度、纯度和完整性；
S7、cDNA文库构建及上机检测，以提取和检测的总RNA样品为材料，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；
S8、转录本Denovo组装和基本注释，对检测数据处理得到高质量的cleanreads，并进行转录本Denovo拼接组装和基本注释；
S9、对cleanreads进行基因差异表达分析；
S10、通过基因差异表达分析，实现对专一性共生结瘤效应确定。


2.根据权利要求1所述的利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于：所述S4中，收获的紫花苜蓿植株处理方式和紫花苜蓿植株的毛根处理方式为：根瘤菌液接种45d后，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分，随机选取，采集苜蓿植株的毛根并混匀，用锡箔纸包裹，并在泡沫盒内迅速用液氮冷冻，保存备用。


3.根据权利要求1所述的利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于：所述S4中，样品的采集部位包括毛根和根瘤。


4.根据权利要求1所述的利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于：所述S5还包括：
S501、向毛根组织和根瘤的混合物中加入液氮，迅速研磨至粉末，加入SL和β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀并离心处理；
S502、将上清液转至过滤柱CS中，离心处理，转移上清液至新的RNase-Free离心管中；
S503、加入无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；
S504、将去蛋白液RW1加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；
S505、将DNaseI储存液加入新的RNase-Free离心管中，再加入RDD溶液，轻柔混匀；
S506、将DNaseI工作液加入吸附柱CR3中央，室温静置；
S507、将去蛋白液RW1加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液；
S508、将漂洗液RW加入吸附柱CR3中，离心处理，弃废液，重复处理；
S509、将S508中的CR3吸附柱离心处理后，转移至新的RNase-Free离心管中，将RNase-FreeddH2O悬空滴入吸附膜中部，室温静置，并离心处理，收集RNA溶液；
S5010、取适量RNA进行浓度测定并进行琼脂糖电泳检测，并保存。


5.根据权利要求1所述的利用转录组学鉴定紫花苜蓿与根瘤菌结瘤专一性的方法，其特征在于：所述S6总RNA的质量检测包括采用Nanodrop超微量...

【专利技术属性】
技术研发人员：康文娟，师尚礼，吴芳，陈永岗，周彤，尹国丽，祁娟，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62