一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法，其中，一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其包括引物、阻断剂和探针；所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。该试剂盒其敏感性和特异性达到筛查大肠肿瘤的要求，操作方便，结果稳定，具有重要的临床价值。

【技术实现步骤摘要】
一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法
本专利技术属于检测大肠癌
，具体涉及一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法。
技术介绍
大肠癌虽然是“可防可治”的肿瘤，但是我们并没有明显降低大肠癌的发病率和死亡率，肿瘤分期仍然是影响预后的唯一因素，探索适合大肠肿瘤的筛查方法是一个亟待解决问题。目前大肠癌筛查技术多使用粪便隐血检查结合乙状结肠镜或结肠镜检查，由于粪便隐血检查的敏感性和特异性较差，许多人不得不反复进行“阴性”肠镜检查，增加受检者的痛苦、增加了医疗费用，因此探索大肠肿瘤的非侵入性筛查方法是目前研究的最为热点的课题。从粪便脱落细胞的分子标记筛查大肠肿瘤和血液分子标记筛查大肠肿瘤是理想的方法，但是敏感性和特异性较低，在临床应用不十分广泛；同时如何增加人们对于大肠肿瘤筛查的意识，探索适合中国人群管理的大肠肿瘤筛查模式，是研究成果能否在临床广泛应用的关键。Imperila等最近进行了一个9988人粪便甲基化检测筛查大肠癌的研究，对大肠癌敏感性达92％、对大肠息肉敏感性达42％，特异性达90％以上，说明通过粪便DNA甲基化可以作为筛查大肠癌和大肠腺瘤的工具。但是DNA甲基化与人种、饮食习惯、生活环境等有关，本组前期研究中，在分析国内现有单靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒的基础上，筛选了一系列的DNA甲基化标志，对其在大肠癌的筛查价值进行了研究，研究表明SNCA、SPG20、Septin9和FBN1可以作为大肠肿瘤的筛查指标，本组设计了以SNCA等四个分子标记为靶点的筛查体系，并建立了阳性和阴性的内控体系，以进一步提高筛查大肠肿瘤的准确性。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。本品用于体外定性检测人粪便中Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因甲基化以筛查大肠癌及其癌前病变的方法。在大肠癌病人中，基因Septin9，SNCA，SPG20，FBN1的胞嘧啶会发生甲基化，而正常人中不发生甲基化。粪便中脱落细胞中的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因发生的甲基化可以用过DNA的特异扩增而被检测到。在针对多个经肠镜确诊的大肠癌病例和阴性对照的研究报告中，都表明可以在大肠癌病人的粪便中通过检测Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因的甲基化而查到早期癌细胞的DNA。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒及其检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其包括引物、阻断剂和探针；所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒的优选方案，其中：所述引物、阻断剂、探针如序列SEQIDNO.1～4、SEQIDNO.6～19。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒的优选方案，其中：还包括内参基因检测体系，所述内参基因的序列如SEQIDNO.5。作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其包括，从粪便中收集肠粘膜细胞；用粪便DNA提取试剂盒提取所述肠粘膜细胞DNA，再用亚硫酸盐进行转化，获得bisDNA；将所述bisDNA进行多重PCR扩增获得模板基因用于检测。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：所述多重PCR扩增检测，其为反应体系为，作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：所述检测，其为反应体系为，选择检测设备的FAM通道，同时选择HEX或VIC通道。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：控制程序温度95℃，先运行1分钟，1次；再运行15s，共45次，结束后采集荧光；再控制程序温度60℃，运行60秒。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：若NC中FAM、HEX(或VIC)通道检测均无扩增或无Ct值，PC中FAM、HEX(或VIC)通道检测均有扩增且Ct值≤30，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：若利用HEX/VIC通道进行内参基因检测，有扩增且Ct值≤25，则可继续分析；若利用HEX/VIC通道进行内参基因检测，Ct值较大或无扩增，但FAM通道的突变位点检测有扩增且Ct值≤38，则可继续分析。作为本专利技术所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法的优选方案，其中：若样品中某突变位点检测的FAM通道有扩增且Ct值≤35，则判定该样本突变结果为阳性；若Ct值>38或无扩增，则判定该样本突变结果为阴性；若35<Ct值≤38，需重复实验，若Ct值仍在此范围内，则判定该样本突变结果为疑似阳性，所述疑似阳性的比例占总体占5％左右。本专利技术的有益效果：本专利技术多靶点粪便DNA甲基化筛查试剂盒其敏感性和特异性达到筛查大肠肿瘤的要求，操作方便，结果稳定，具有重要的临床价值；当四个分子标志中，有一个标志为DNA甲基化阳性时，就需要进行肠镜检查；随着甲基化标志增加，其诊断的特异性逐渐升高，当2个以上标志DNA甲基化阳性时，患者阳性预测值达到90％以上，属于极高风险结直肠癌或者结直肠息肉患者患者，需要立即进行肠镜检查和治疗，以发现结肠息肉或结直肠癌；当四个分子标记均为阴性时，可以排除受检者有结直肠癌可能。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为典型阳性结果曲线图，其中，1表示阳性对照，为灰色，2表示ACTB，为深绿色，3表示SEPT9为浅绿色，4表示SPG20为紫色，5表示SCNA，为深蓝色，6表示FBN1为浅蓝色，7表示阴性对照，为红色，纵坐标为荧光强度0～140，横坐标为循环数0～40，1～6各曲线从循环数13开始依次分离，对应的循环数为13、18、18、24、24、26；图2为典型阴性结果曲线图，其中，1表示阳性对照S，为灰色，对应循环数为13；2表示ACTB为红色，对应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：包括引物、阻断剂和探针；/n所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；/n所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；/n所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：包括引物、阻断剂和探针；
所述引物包括针对Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因不含CpG双碱基的序列区域设计的序列的一种或几种；
所述阻断剂包括在没有发生甲基化而被亚硫酸盐转化后的序列区域设计的序列的一种或几种；
所述探针包括针对发生甲基化的Septin9，SNCA，SPG20，FBN1基因序列设计的特异性荧光素探针的一种或几种。


2.如权利要求1所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：所述引物、阻断剂、探针如序列SEQIDNO.1～4、SEQIDNO.6～19。


3.如权利要求1或2所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌试剂盒，其特征在于：还包括内参基因检测体系，所述内参基因的序列如SEQIDNO.5。


4.一种多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：包括，
从粪便中收集肠粘膜细胞；
用粪便DNA提取试剂盒提取所述肠粘膜细胞DNA，再用亚硫酸盐进行转化，获得bisDNA；
将所述bisDNA进行多重PCR扩增获得模板基因用于检测。


5.如权利要求4所述的多靶点粪便DNA甲基化检测大肠癌的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增检测，其为反应体系为，





6.如权利要求4所述的多靶点粪便D...

【专利技术属性】
技术研发人员：金黑鹰，金一夫，侯振婕，
申请(专利权)人：南京普派医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32