利用树木内生菌的发酵液抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法技术

利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，它涉及一种利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法。本发明专利技术是这样进行的：从白蚁体内分离具有木质素和／或纤维素分解能力的共生菌作为指示菌；从抗白蚁树木中分离树木内生菌，对其进行发酵，得到树木内生菌代谢产物；利用树木内生菌代谢产物采用牛津杯法对白蚁共生菌作抑菌试验；用对白蚁的共生菌有抑制作用的树木内生菌代谢产物浸泡滤纸片，对白蚁进行饲喂试验。经过统计分析表明：试验组白蚁取食滤纸片的量明显比对照组少，而实验组白蚁的死亡率明显多于对照组，差异极其显著；从白蚁的活动情况上来看实验组的白蚁活动比对照组弱，从而说明发酵液中含有能抗白蚁的化合物。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种内生菌的分离方法，具体涉及一种利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法。
技术介绍
现有的杀灭白蚁的药剂均为化学药剂，故都有很大的毒副作用，造成严重的环境污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，该方法通过微生物生产对人畜无毒或低毒的可以抗白蚁的化合物。本专利技术是这样利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌从而实现抗白蚁方法的(一)从白蚁体内分离具有木质素和/或纤维素分解能力的共生菌作为指示菌；(二)从抗白蚁树木中分离树木内生菌，对其进行发酵，得到树木内生菌代谢产物；(三)利用树木内生菌代谢产物采用牛津杯法对白蚁共生菌作抑菌试验；(四)用对白蚁的共生菌有抑制作用的树木内生菌代谢产物浸泡滤纸片，对白蚁进行饲喂试验。本专利技术从能抗白蚁的树木之中分离其内生菌，通过发酵生产获得其代谢产物，利用代谢产物抑制白蚁体内有较强木质素、纤维素分解能力的共生菌，进而做白蚁的饲喂试验，结果证明能够抑制白蚁共生菌的树木内生菌的代谢产物也对白蚁有较好的抑制作用。本专利技术采用从白蚁体内分离的有较强木质素、纤维素分解能力的共生菌作为指示菌，先通过牛津杯法作抑菌试验检验从Western Red Cedar和Port-orford-cedar中分离出内生菌的发酵产物对白蚁共生菌是否有抑制作用，进而用对白蚁的共生菌有抑制作用的发酵产物浸泡滤纸片对白蚁进行饲喂试验。经过白蚁的药物饲喂试验，并且经过统计分析表明试验组白蚁取食滤纸片的量明显比对照组少，而实验组白蚁的死亡率明显多于对照组，差异极其显著；从白蚁的活动情况上来看实验组的白蚁活动比对照组弱，从而说明发酵液中含有能抗白蚁的化合物。对白蚁的共生菌有较好抑制作用的发酵产物对白蚁也有较好的杀灭作用，而且二者有呈线性关系的趋势，这就为杀白蚁生物药剂的筛选及快速检测提供了一种简洁而可行的新的途径。具体实施例方式具体实施例方式一本实施方式是这样利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌从而实现抗白蚁方法的(一)从白蚁体内分离具有木质素和/或纤维素分解能力的共生菌作为指示菌；(二)从抗白蚁树木中分离树木内生菌，对其进行发酵，得到树木内生菌代谢产物；(三)利用树木内生菌代谢产物采用牛津杯法对白蚁共生菌作抑菌试验；(四)用对白蚁的共生菌有抑制作用的树木内生菌代谢产物浸泡滤纸片，对白蚁进行饲喂试验。所述抗白蚁树木为Western Red Cedar和port-orford-cedar。具体实施例方式二本实施方式是这样利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌从而实现抗白蚁方法的一、材料的选取1、Western Red Cedar(2003年9月10日取样于美国路易斯安纳州)2、port-orford-cedar(2003年9月取样于美国俄勒冈州)3、黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)(取样于中国武汉市珞珈山)4、美国白蚁(取样于美国路易斯安纳州立大学)二、培养基的配制(一)指示菌培养基1、纤维素培养基1.1细菌纤维素培养基CMC-Na(羧甲基纤维素钠简称CMC)10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、琼脂20g、水1000ml。1.2真菌纤维素培养基CMC-Na10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、琼脂20g、水1000ml。1.3放线菌纤维素培养基CMC-Na10g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、水1000ml。1.4酵母菌纤维素培养基CMC-Na5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸钠8.2g、琼脂20g、水1000ml。2、木质素培养基2.1木质素的制备称取2g锯末，用定性滤纸包好，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液(苯∶乙醇＝2∶1)，置沸水浴中抽提6小时(控制抽提液循环次数每小时4次)；抽提完后，将试样取出风干，转入已预冷的12～15℃含15ml 72％的浓硫酸的250ml具塞锥形瓶中，塞紧瓶塞，摇荡1min，使试样全部浸渍在酸液中，然后恒温在18～20℃下保温2.5小时，并经常摇动锥形瓶；保温后转入1000ml锥形瓶中，加345ml蒸馏水稀释至酸浓度为3％，保持其浓度不变煮沸4小时，静置，过滤，将滤渣烘干到恒重，即为木质素。2.2细菌木质素培养基木质素10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、琼脂20g、水1000ml。2.3真菌木质素培养基木质素10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、琼脂20g、水1000ml。2.4放线菌木质素培养基木质素5g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂20g、水1000ml。2.5酵母菌木质素培养基木质素5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸钠8.2g、琼脂20g、水1000ml。(二)树木内生菌的分离培养基1、水琼脂浸汁培养基用灭过菌的解剖刀将5g红柏木材切成小块，加入100ml水煮沸30min，取20ml树木浸汁，加入15～20g琼脂，加水至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30min后，分装到培养皿内备用。2、查氏培养基NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、琼脂20g、水1000ml。3、PDA培养基马铃薯200g、蔗糖20g、水1000ml、琼脂20g。4、S-7培养基葡萄糖1g、果糖3g、蔗糖6g、醋酸钠1g、蛋白胨1g、维生素B11mg、维生素H1mg、维生素B61mg、泛酸钙1mg、MgSO43.6mg、Ca(NO3)26.5mg、Cu(NO3)21mg、ZnSO42.5mg、MnCl25mg、FeCl32mg、苯丙氨酸5mg、苯酸钠100mg、1mol/l的KH2PO4缓冲液1ml、水1000ml、pH自然。(四)抑菌试验所用的培养基双层培养基在平皿中倾入10ml素琼脂，在37℃温箱中过夜检菌，把无菌牛津杯立在素琼脂平板上，倾入15ml混有菌悬液的半固体培养基，待半固体培养基凝固后，用无菌镊子拔出牛津杯。三、方法1、从白蚁中分离共生菌a、将从蚁巢中收集的白蚁切去头部和胸部，腹部置于已灭菌的培养皿中，用0.1％升汞消毒1～2min或者用75％的乙醇消毒3～4min，用无菌水冲洗3次后，无菌操作将20只白蚁腹部转入消过毒的研钵中，研磨成匀浆，匀浆作一系列的稀释备用，与此同时，将消过毒的白蚁腹部于计数培养基平板上滚动擦拭，此平板与计数平板一起培养，以检验白蚁表面消毒是否彻底，如果消毒不彻底，需要重新操作；b、用移液枪取0.2ml白蚁匀浆，分别加入细菌、真菌、酵母菌、放线菌的纤维素培养基和木质素培养基平板中，用涂棒涂布均匀，细菌在37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，其特征在于它按照下述步骤进行：（一）从白蚁体内分离具有木质素和／或纤维素分解能力的共生菌作为指示菌；（二）从抗白蚁树木中分离树木内生菌，对其进行发酵，得到树木内生菌代谢产物；（三）利用树木内生菌代谢产物采用牛津杯法对白蚁共生菌作抑菌试验；（四）用对白蚁的共生菌有抑制作用的树木内生菌代谢产物浸泡滤纸片，对白蚁进行饲喂试验。

【技术特征摘要】
1.利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，其特征在于它按照下述步骤进行(一)从白蚁体内分离具有木质素和/或纤维素分解能力的共生菌作为指示菌；(二)从抗白蚁树木中分离树木内生菌，对其进行发酵，得到树木内生菌代谢产物；(三)利用树木内生菌代谢产物采用牛津杯法对白蚁共生菌作抑菌试验；(四)用对白蚁的共生菌有抑制作用的树木内生菌代谢产物浸泡滤纸片，对白蚁进行饲喂试验。2.根据权利要求1所述的利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，其特征在于所述从白蚁中分离共生菌是这样进行的a、白蚁切去头部和胸部，将腹部置于已灭菌的培养皿中进行消毒后，用无菌水冲洗，无菌操作将白蚁腹部转入消过毒的研钵中，研磨成匀浆；b、用移液枪取白蚁匀浆，分别加入细菌、真菌、酵母菌、放线菌的纤维素培养基和木质素培养基平板中，用涂棒涂布均匀，细菌在37℃下培养，其它菌在28℃下培养；c、3～7d后培养基长出菌，用三区划线法分离出单菌落，鉴定产酶能力的强弱后转入斜面保存，从中挑选出指示菌。3.根据权利要求1所述的利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，其特征在于所述分离树木内生菌的方法是这样实现的用刀将抗白蚁树木的树枝切成1.0～1.5厘米的小段，把处理过的小木块接入水琼脂浸汁培养基中，3～5d分离培养基上长出菌；用三区划线法分别把菌接入相应的牛肉膏蛋白胨、查氏、马丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨培养基，分离出单菌落，然后分别把分离到的菌接入相应的牛肉膏蛋白胨、查氏、马丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨斜面中，得到树木内生菌。4.根据权利要求1所述的利用树木内生菌的代谢产物抑制白蚁共生菌的抗白蚁方法，其特征在于所述采用牛津杯法作抑菌试验是这样进行的取20ml半固体培养基加入小锥形...

【专利技术属性】
技术研发人员：周东坡，平文祥，许中允，李强，刘军，周刚，韩雅红，赵凯，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]