一个木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一个木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A及其表达载体和应用。该木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自普通小麦(Triticum asetivum L.)品种扬麦17。将TaRD21A基因插入表达载体pBI220多克隆位点，获得超表达载体pBI220‑TaRD21A，并通过基因枪法转化感病小麦品种扬麦13。T

【技术实现步骤摘要】
一个木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A及其表达载体和应用
本专利技术属于基因工程领域，公开了一个木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A及其表达载体和应用。
技术介绍
小麦(TriticumaestivumL.)赤霉病(Fusariumheadblight,FHB)是主要由禾谷镰刀菌(Fusarium)引起的真菌病害，广泛发生于世界温暖湿润和半湿润地区，我国长江中下游冬麦区和东北春麦区以及华南麦区(现少有种植)为重发区。近年来，由于秸秆还田、降水增加等原因，赤霉病迅速向黄淮麦区蔓延，已成为我国小麦生产的一大隐患。在2012年的赤霉病全国大流行中，发病面积超过1亿亩，程顺和等调查发现山东省南部和西南部较重，河南省整体偏重，豫南更重，安徽和江苏省普遍发生严重。赤霉病不仅造成大幅度粮食减产，由禾谷镰刀菌产生的赤霉毒素还会严重污染食品和饲料，威胁人畜健康。赤霉病侵染麦穗后籽粒中积累脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和瓜萎镰菌醇(NIV)及其衍生物(4ANIV,3ADON和15ADON)等毒素，是世界公认的强烈致癌物质。只要感染赤霉病，籽粒中就会积累DON等毒素。因此不同国家对食物中DON毒素的含量有着严格的规定，最高容忍度为1.5ppm。赤霉病流行年份中抗至高感赤霉病的品种籽粒中DON毒素往往严重超标，不宜作为动物饲料和食品进入食物链。可见，赤霉病的流行不仅影响粮食安全，而且严重影响食品安全。多年来选育和推广小麦抗病品种一直是植病学家和育种工作者致力解决和防治小麦赤霉病的主要手段。因此，加强小麦赤霉病抗病相关基因的挖掘利用以及抗病遗传基础的理论研究，对于选育抗赤霉病品种具有重要意义。小麦品种扬麦17，高抗赤霉病，多年种植对赤霉病表现出了稳定的抗性。因此，开展小麦-赤霉病互作机理研究及重要抗赤霉病相关基因的克隆，对于抗赤霉病育种具有重要的指导价值。本专利技术利用小麦基因芯片技术从转录组水平上了解小麦与赤霉病互作的基因表达特征，从中筛选了一个在扬麦17中上调表达3倍以上的基因TaRD21A，将该基因转入赤霉病小麦品种扬麦13中使基因超量表达，可显著提高小麦的赤霉病抗性。本专利技术提供的TaRD21A基因超量表达载体为开展抗赤霉病小麦基因工程育种提供基因基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A的表达载体和应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A来自普通小麦(TriticumasetivumL.)扬17，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A蛋白质为TaRD21A，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。含木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A的重组表达载体构建。所述的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将TaRab18基因插入pBI220的BamH1和KpnI酶切位点间所得。所述的含木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A的表达载体在抗赤霉病小麦品种中的应用。有益效果本专利技术从小麦中克隆得到了一个木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A及其所编码的蛋白质TaRD21A，该基因在含有抗赤霉病小麦扬麦17中受赤霉菌诱导表达，而在感病小麦扬麦13中不受赤霉菌诱导表达。将TaRD21A插入超表达载体pBI220，并导入感病小麦品种扬麦13中，可以提高扬麦13对赤霉菌的抗性。附图说明图1、探针Ta.14289的RACE及基因全长cDNA扩增结果A：5′和3′RACE扩增结果；B：基因全长cDNA扩增结果。图2、TaRD21A受赤霉菌诱导表达的qRT-PCR分析横坐标表示赤霉菌诱导0、24、48、72、96小时的小麦穗部组织TaRD21A表达量。图3、TaRD21A超量表达载体的构建A：植物表达载体pBI220；B：重组超表达载体pBI220:TaRD21A图4、pBI220:TaRD21A部分转基因植株T3代PCR分子鉴定M：DL2000DNA标准分子量；CK+：质粒，CK—：扬麦13受体；1～3：T3转基因阳性植株图5、TaRD21A转化扬麦13的T3代阳性植株的条锈病抗性鉴定1：感病对照扬麦13，T32-1、T32-2、T32-3：转基因阳性株系具体实施方式实施例1受赤霉菌诱导表达的木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆为了克隆扬麦17中抗赤霉病相关基因，采用基因芯片杂交法筛选抗赤霉病小麦品种扬麦17中的接种赤霉菌和接水对照24小时差异表达基因。从中筛选出一上调表达7.6倍的EST探针Ta.14289。以此探针序列为基础，通过RACE得到了预期长度的扩增产物(图1A)，拼接后序列长度为1605bp。根据拼接序列设计全长引物P1(CTGGTCACGTTGATGTTGC，SEQIDNO.3)，P2(GCGGTGTTTCGCATGGCC,SEQIDNO.4)。通过RT-PCR得到预期长度1562-bp的扩增产物(图1B)，并将其回收、克隆、测序，扩增产物与拼接序列一致。经ORFfinder分析，cDNA序列编码区119～1529-bp，长1410-bp，序列如SEQIDNO.1所示。编码469个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。经BLASTP比对该蛋白序列与大麦RD21A同源性达95.3％，进化分析表明该蛋白属于木瓜类半胱氨酸蛋白酶家族，且属于RD21A亚家族，因此将该基因命名为TaRD21A。经SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析，TaRD21A编码蛋白序含有典型的3个保守结构域:Inhibitor_129、Peptidase_C1、GRAN。实施例2TaRD21A受赤霉菌诱导的表达特征分析为了研究TaRD21A在抗、感病材料中的表达模式，利用抗病材料扬麦17和感病材料扬麦13经条锈菌诱导0、24、48、72、96小时的RNA反转录cDNA为模板，利用P3(GCCCGAGGCCGTCGACTGGAGG，SEQIDNO.5)和P4(GCCACCGTTCTTTATGATGAAC，SEQIDNO.6)为引物进行实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2×SYBRGreenPCRMasterMix10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在扬麦17中，TaRD21A受赤霉菌诱导上调表达，24小时上调显著，48h后表达水平最高；而扬麦13中，各时间点TaRD21A的表达均显著低于扬麦17(图2)。实施例3Ta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A，来自普通小麦(Triticum asetivum L.)品种扬麦17，其特征在于其ORF序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21A，来自普通小麦(TriticumasetivumL.)品种扬麦17，其特征在于其ORF序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的基因TaRD21A编码的蛋白质，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO.2。


3.含有权利要求1所述的基因TaRD21A的重组表达载体。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋正宁，高德荣，别同德，张勇，赵仁慧，吴旭江，胡文静，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32