一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法技术

本发明专利技术公开了一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，本发明专利技术首次将细胞松弛素B应用于皮肤模型的固体保存中，采用三步法进行处理，该处理方法可以维持模型在运输过程中的细胞活性，减少细胞缺氧性损伤，以保证3D重皮肤组模型测试的准确性和细胞的活力，并极大程度延长保存时间。

【技术实现步骤摘要】
一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法
本专利技术涉及一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，属于生物医学领域。
技术介绍
随着体外器官培养基体外替代技术的发展，基于3D体外细胞培养构建的3D重组皮肤模型在刺激性试验安全性及有效性评价方面表现出特有的趋势。体外构建的3D表皮模型类似于人体皮肤结构，可以用于化妆品检测的体外替代试验；体外构建的3D全层皮肤是具有活细胞的组织工程皮肤，具有表皮层和真皮层，可以参与创面与伤口的修复，可用于由多种原因引起的皮肤缺损的修复，加快皮肤创伤的愈合，并形成功能性的皮肤，以此来减轻患者疼痛，提高患者的生活质量。但是，由于体外3D重组皮肤模型的特点，要求模型具有稳定性，并且在长距离运输过程中能够很好的保持其原有的特性，以期能够测试并检验出化学物质或其他因素对其影响，从而得到准确的结果。而全层皮肤用于临床上也需要克服异地运输的困难，以保证运输后的皮肤具有一定的活性，从而确保临床应用的效果。目前关于适用于低温保存运输皮肤模型及组织工程皮肤的固体培养基已有相关报道(如中国专利201410418456.X，201510697694.3，201510697887.9)，但目前固体保存仍有较大局限性，其保存时间仍为限制性因素。细胞松弛素B具有多种生物学功能，尤其是对于微丝结构的影响，它作为冷冻保护剂，可以增加细胞骨架弹性，这对于我们进行低温保存而言至关重要，目前已有中国专利201410418456.X将细胞松弛素B添加于保存液中，但迄今为止，已报道的文献中关于细胞松弛素B的利用均发生在液体环境中，并且剂量添加和处理时间长短的差异对细胞或组织都会产生巨大影响。由于固体保存较液体保存溶液流动性差，许多分子运动受限，致使物质交换能力降低，这在很大程度上限制了固体保存时限的延长。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，提供一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，本专利技术首次将细胞松弛素B应用于皮肤模型的固体保存中，该处理方法可以维持模型在运输过程中的细胞活性，减少细胞缺氧性损伤，以保证3D重皮肤组模型测试的准确性和细胞的活力，并极大程度延长保存时间。一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，包括如下步骤：1)利用细胞培养技术培养3D重组皮肤模型；2)在步骤1)培养的3D重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素B，添加的细胞松弛素B在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；3)将经过步骤2)处理的3D重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3D重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。进一步的，上述步骤2)中所述的细胞培养液是以基础培养基为主体添加生长因子的培养液；所述基础培养基为DMEM、F12或DMEM和F12复配的混合液，所述DMEM和F12复配的混合液中DMEM和F12体积比为4:1-12。所述生长因子包括氢化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)、人表皮生长因子(hEGF)、牛垂体提取物(BPE)、硒、胎牛血清。进一步的，上述氢化可的松在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml、上述腺嘌呤在基础培养基中的终浓度为10～30mM、上述ITT在基础培养基中的终浓度为5.0～10.0ug/ml，上述L-谷氨酰胺的浓度为30～60mM，上述EOP在基础培养基中的终浓度为1～10mM，上述人表皮生长因子(hEGF)在基础培养基中的终浓度为0.1～1ng/ml，上述硒在基础培养基中的终浓度为10-3～0.1nM，上述牛垂体提取物(BPE)在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml，胎牛血清在基础培养基中的体积分数为2～10％。进一步的，上述步骤3)中所述的改良的液体保存液的制备方法包括如下步骤：S1配制细胞培养液；S2在步骤S1获得的细胞培养液中添加细胞松弛素B、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素C、维生素E、透明质酸、硫酸软骨素、去铁胺、1,6-二磷酸果糖，即可获得改良的液体保存液。进一步的，上述步骤S2中所述细胞松弛素B在液体保存液中的终浓度1-2ug/ml，所述海藻糖在液体保存液中的终浓度为1～20mM，所述蔗糖在液体保存液中的终浓度为50～100mM，所述甘氨酸在液体保存液中的终浓度为1～20mM，所述丙氨酸在液体保存液中的终浓度为1～10mM，所述腺苷在液体保存液中的终浓度为1～10mM，所述维生素E在液体保存液中的终浓度为10mM～30mM，所述维生素C在液体保存液中的终浓度为10mM～40mM，所述去铁胺在液体保存液中的终浓度为1mM～10mM，所述1,6-二磷酸果糖在液体保存液中的终浓度为1～15mM、所述透明质酸在液体保存液中的体积分数为0.01～1％、所述硫酸软骨素在液体保存液中的终浓度为0.5～2g/L。进一步的，上述步骤4)中所述的改良的固体培养基由琼脂糖溶液与改良的液体保存液按照体积比1:1混合均匀后凝固而成。进一步的，上述琼脂糖溶液的浓度为0.25％～5％，所述琼脂糖为低熔点琼脂糖，熔点为60～70℃，凝固温度为28℃～32℃。有益效果：(1)使用本专利技术的方法可以最大程度减轻重组模型在运输过程中遭遇的如低温、高渗等不利因素对细胞骨架所造成的损伤，维持重组皮肤的细胞活性，保证模型测试结果的准确性以及临床应用的良好效果。(2)该方法将保存时间延长至120h以上，极大额延长保存时间以确保长距离的低温运输，更利于组织工程应用产业化的实现。(2)细胞松弛素B由适宜低浓度到高浓度可以减缓温度变化对细胞骨架形变所产生的影响；三步法中第二步处理，提前在4℃对模型进行液体保存，由于液体保存较固体保存流动性强，能提高保存液中各种保护成分与皮肤模型进行物质交换的能力，最大程度维持温度降低时的皮肤内外渗透压，此后再进行后续固体保存，经过本方法的处理可以极大程度减轻固体保存过程对皮肤模型的损伤，延长保存时限。(3)该方法可以适用于2种以上3D重组皮肤模型的低温运输，可用于多种3D重组皮肤模型(3D表皮模型、3D全层皮肤模型、3D真皮模型)的保存。(4)在使用模型前，将模型放入复苏培养基中培养21±3h后，即可用于检测，使用方便快捷，且复苏后原皮肤模型的功能不会有不良影响。附图说明图1固体保存和液体保存对皮肤模型的不同应用效果。图2不同浓度细胞松弛素B对皮肤真皮成纤维细胞和表皮细胞活性的影响。图33D表皮模型和3D全层皮肤模型低温保存复苏结果对比。图4不同条件下，表皮模型H&E染色结果。图5正常条件下全层皮肤模型移植结果。图6全层皮肤模型经本专利技术的方法保存120h复苏后小鼠移植结果。图7使用细胞松弛素B直接进行固体方法保存120h复苏后小鼠移植结果。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)利用细胞培养技术培养3D重组皮肤模型；/n2)在步骤1)培养的3D重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素B，添加的细胞松弛素B在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；/n3)将经过步骤2)处理的3D重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；/n4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3D重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。/n

【技术特征摘要】
1.一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用细胞培养技术培养3D重组皮肤模型；
2)在步骤1)培养的3D重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素B，添加的细胞松弛素B在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；
3)将经过步骤2)处理的3D重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；
4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3D重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。


2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，步骤2)中所述的细胞培养液是以基础培养基为主体添加生长因子的培养液；
所述基础培养基为DMEM、F12或DMEM和F12复配的混合液，所述DMEM和F12复配的混合液中DMEM和F12体积比为4:1-12；
所述生长因子包括氢化可的松、腺嘌呤、ITT、L-谷氨酰胺、EOP、人表皮生长因子、牛垂体提取物、硒、胎牛血清。


3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述氢化可的松在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml、所述腺嘌呤在基础培养基中的终浓度为10～30mM、所述ITT在基础培养基中的终浓度为5.0～10.0ug/ml，所述L-谷氨酰胺的浓度为30～60mM，所述EOP在基础培养基中的终浓度为1～10mM，所述人表皮生长因子在基础培养基中的终浓度为0.1～1ng/ml，所述硒在基础培养基中的终浓度为10-3～0.1nM，所述牛垂体提取物在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霄，邢志青，张甜甜，王杰，张平，郑海阳，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37