用于表征蛋白质二聚化的系统和方法技术方案

提供了在蛋白质的亚结构域水平上表征二聚化界面的系统和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域、标记所述消化的蛋白质样品、分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段以及对所述标记的样品进行肽作图以确定所述二聚体片段被标记的位置和所述二聚体片段未被标记的位置。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与所述二聚化界面有关或非常接近。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征蛋白质二聚化的系统和方法相关专利申请的交叉引用本申请要求于2018年2月2日提交的美国临时专利申请No.62/625,732和于2018年9月28日提交的美国临时专利申请No.62/738,051的优先权，将这两个美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
本专利技术整体涉及用于表征蛋白质及其片段中的非共价相互作用位点的分析方法和系统。
技术介绍
在过去的20年中，单克隆抗体(mAb)已经成功地用于靶向各种治疗领域(WalshG.,Naturebiotechnology2014；32:992-1000；LawrenceS.Naturebiotechnology2007；25:380-2)。蛋白质聚集仍然是单克隆抗体和其他治疗性蛋白质制备中的主要问题。由于对效力和免疫原性的潜在影响，理解聚集机制非常重要，以使得可实施适当的控制策略来确保产品品质。由于mAb二聚体的复杂性和异质性，对mAb分子中的二聚化界面进行作图仍然具有挑战性。尽管氢-氘交换质谱(HDXMS)已经成功地研究了蛋白质-蛋白质相互作用，但在揭示mAb二聚化界面方面几乎没有取得成功，这可能是由于检测蛋白质侧链相互作用的方法局限性。因此，本专利技术的目的是提供用于对蛋白质的异质二聚化界面进行作图的系统和方法。本专利技术的另一个目的是提供二聚化水平降低的蛋白质药物产品。本专利技术的另一个目的是提供制备二聚化减少的蛋白质药物产品的方法。
技术实现思路
本专利技术提供在蛋白质的肽/残基水平上表征蛋白质二聚化界面的系统和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域，标记经消化的蛋白质样品混合物，分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段，以及对标记的样品进行肽作图以确定并比较二聚体中和单体中的标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。在一个实施方案中，分离非共价二聚体并通过肽作图分析以定位非共价相互作用位点。在用以在肽/残基水平上定位非共价二聚化界面的另一个实施方案中，将富集的mAb二聚体样品消化成F(ab)[或F(ab')]同型二聚体、F(ab)[或F(ab')]单体和Fc单体的混合物，并使其接受标记实验，随后进行分级分离、胰蛋白酶消化和LC-MS分析，用于肽/残基水平上的标记程度量化和比较。下文提供所公开的方法的步骤的更多细节。另一个实施方案提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞，从所述细胞培养物获得样品，根据上述方法表征所述抗体样品中的二聚化界面，以及修改所述细胞培养物的一种或多种培养条件以减少细胞培养期间所产生的抗体的二聚化或非共价相互作用/聚集的量。在一些实施方案中，在细胞培养期间以任一间隔采集样品。在其他实施方案中，在制备培养后、在蛋白质收获后或在纯化后采集样品。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种细胞培养条件可选自温度、pH、细胞密度、氨基酸浓度、渗透压、生长因子浓度、搅拌、气体分压、表面活性剂或它们的组合。所述细胞可为真核细胞或原核细胞。所述细胞可为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如CHOK1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS细胞(如COS-7)、视网膜细胞、Vero细胞、CV1细胞、肾细胞(如HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa细胞、HepG2细胞、WI38细胞、MRC5细胞、Colo25细胞、HB8065细胞、HL-60细胞、诸如自体T细胞、Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)等的淋巴细胞、A431(表皮)细胞、U937细胞、3T3细胞、L细胞、C127细胞、SP2/0细胞、NS-0细胞、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞以及衍生自任一前述细胞的细胞系。在一个实施方案中，所述细胞是杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)细胞。另一个实施方案提供制备抗体的方法，包括以下步骤：在细胞培养物中培养产生所述抗体的细胞，然后纯化并配制所述抗体以获得配制药物物质(FDS)，在配制所述抗体之前和/或之后获取所述纯化抗体的样品，根据上述方法表征所述抗体样品或FDS样品中的二聚化界面，以及修改所述抗体纯化或配制的一种或多种条件以减少细胞培养期间所产生的抗体的二聚化或非共价相互作用/聚集的量。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种抗体纯化条件可选自温度、pH、亲和基质、色谱树脂、缓冲液、过滤器或它们的组合。经改变以减少二聚化或聚集的量的一种或多种抗体配制条件可选自pH、抗体浓度、赋形剂浓度、缓冲液、表面活性剂、稳定剂或它们的任何组合。可改变FDS的一种或多种赋形剂以减少二聚化或聚集的量，并且所述赋形剂选自本领域已知赋形剂中的任一者。另一个实施方案提供通过本文所述方法制备的抗体。本文也提供用于提供经修饰的蛋白质药物产品的方法，所述经修饰的蛋白质药物产品相对于未修饰的蛋白质药物产品具有减少的二聚化或非共价相互作用。在一个实施方案中，蛋白质药物产品是单克隆抗体或其抗原结合片段。附图说明图1是用于mAb二聚化界面作图的示例性有限消化和单标记策略的工作流程图。图2是所指示链/残基的甘氨酸乙酯盐酸盐(GEE)(单体-二聚体)的百分比图，其显示了由富集HMW样品的有限Lys-C消化产生的mAb-1Fab二聚体与Fab单体之间的差异GEE标记图。图3A是肽水平上所指示mAb-1抗体片段的GEE百分比的条形图。图3B是氨基酸残基水平上所指示mAb-2抗体片段的GEE百分比的条形图。图4A-4C是散点图，显示了有限LysC消化的mAb1HMW样品的氧化物质的泊松拟合(Poissonfitting)。图4A展示Fc区，图4B展示LC区，图4C展示Fd区。线条表示每个图的泊松拟合。图5A是在mAb-1的肽水平上所指示片段的FPOP修饰程度的条形图。图5B是在mAb-1的残基水平上所指示片段的FPOP修饰程度的条形图。图6A和6B是散点图，显示了在不同聚焦位置和激光功率条件下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。图7A-7F是散点图，显示了在各种清除剂浓度(500μM、350μM或200μMHis)和各种激光功率设置(97mJ或156mJ)下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。图8A-8D是散点图，显示了在各种清除剂浓度(500μM或200μMHis)和各种蛋白质浓度(1mg/mL或0.1mg/mL)下溶菌酶蛋白的氧化物质的泊松拟合。图9A-9B是散点图，显示了mAb1(图9A)或去糖基化mAb1(图9B)的氧化物质的泊松拟合。具体实施方式I.定义在描述当前要求权利保护的本专利技术的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且将每个单独的值并入本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法，包括：/n在原生条件下采用对蛋白质药物产品的有限消化以形成包含单体和非共价连接的二聚体的蛋白质药物二聚体样品混合物；/n将可检测的修饰引入所述蛋白质药物二聚体样品混合物的所述二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体；/n使用原生尺寸排除色谱将所述经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分；/n消化所述经修饰的二聚体级分和所述经修饰的单体级分以形成肽样品；/n使用液相色谱/质谱(LC-MS)分离所述肽样品以获得所述肽样品的质谱数据；/n通过计算所述蛋白质药物产品的每种肽和经修饰肽的质量，使用所述肽的所述质谱数据与所述蛋白质药物产品的已知质量数据进行比较，确定所述肽样品中的每种肽的修饰位点。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180202 US 62/625,732;20180928 US 62/738,0511.一种用于鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法，包括：
在原生条件下采用对蛋白质药物产品的有限消化以形成包含单体和非共价连接的二聚体的蛋白质药物二聚体样品混合物；
将可检测的修饰引入所述蛋白质药物二聚体样品混合物的所述二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体；
使用原生尺寸排除色谱将所述经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分；
消化所述经修饰的二聚体级分和所述经修饰的单体级分以形成肽样品；
使用液相色谱/质谱(LC-MS)分离所述肽样品以获得所述肽样品的质谱数据；
通过计算所述蛋白质药物产品的每种肽和经修饰肽的质量，使用所述肽的所述质谱数据与所述蛋白质药物产品的已知质量数据进行比较，确定所述肽样品中的每种肽的修饰位点。


2.根据权利要求1所述的方法，其中原生有限消化条件可保留多肽之间的二硫键和二聚体之间的非共价相互作用。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过快速光化学氧化来修饰所述二聚体和单体以使可检测的氧化修饰形成于所述二聚体和单体中。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品包含抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或它们的组合。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述二聚体基本上由两个相互作用的F(ab’)或F(ab)片段组成。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述单体基本上由F(ab)片段和Fc片段组成。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述修饰是氨基酸侧链修饰。


8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或它们的抗原结合片段。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用包含乙酸铵和碳酸氢铵的流动相进行所述原生尺寸排阻色谱。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用反相液相色谱分离所述消化的蛋白质样品。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述修饰选自氧化、二氧化、三氧化、犬尿氨酸、脱硫甲基、脱羧化、羟基犬尿氨酸以及它们的组合。


12.根据权利要求1或2所述的方法，其中用酶消化所述蛋白质药物产品。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、内切蛋白酶Lys-C和IdeS或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王顺海，严悦天，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US