RNA转录载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种改进的RNA转录载体，其非常适合用于产生用于体内治疗目的的mRNA。载体中的改进在于翻译增强子(TE)和核保留元件(NRS)的存在，特别是当后者是卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的“表达和核保留元件”(ENE)时。

【技术实现步骤摘要】
RNA转录载体及其用途本申请是中国专利申请CN201480071159.0的分案申请。专利
本专利技术总的来说涉及一种改进的RNA转录载体，其非常适合用于产生用于体内治疗目的的mRNA。载体中的改进特别地在于翻译增强子和核保留元件的存在。专利技术背景虽然我们的免疫系统能够区分健康细胞与肿瘤细胞和感染原，但它有时无法适当识别该问题并对其作出反应。因此，医学已经聚焦于开发几种帮助免疫系统监视和消除肿瘤细胞和感染原的策略。树突状细胞(DC)是已知为免疫应答刺激中的关键参与者的抗原提呈细胞(APC)并且已付出许多努力来在免疫疗法中开发DC。例如在癌症的情况下，目标是通过诱发可以特异性降低肿瘤负荷并诱导免疫记忆以控制肿瘤复发的效应T细胞来诱导和保持肿瘤特异性免疫应答。一旦可靶向的肿瘤相关抗原(TAA)已被识别，它们可用于在体内或离体加载专职APC，即树突状细胞。已关于DC就体内或离体免疫疗法评估了不同的抗原形式，例如肽、蛋白质、全肿瘤细胞提取物、质粒DNA或mRNA。在这些方法中，编码抗原的mRNA正作为为特别有前景的方法出现。相对于使用肽的传统疫苗接种的优点是mRNA编码整个抗原的遗传信息。全长抗原是经加工的并且所有可用的表位提呈在患者的MHC分子中，而不需要确定HLA特异性肽。没有患者需要因可用的肽不匹配其HLA类型而被从治疗中排除。此外，mRNA不构成基因组整合的风险，从而使其相较于DNA或病毒载体具有有利的安全性特征。由于它的瞬时性质，mRNA仅在短时期过程中表达，并最终降解成天然产物。另外，mRNA用作其自身的佐剂，促进共刺激信号，这在基于mRNA的免疫疗法的情况下是有利的。已应用了用于外源mRNA递送到DC中的两条路径：离体使用经转染的DC的后续过继转移或通过mRNA的直接施用和体内摄取。由Diken等人(2011)进行的研究突出显示成熟刺激和/或其递送的时间选择必须仔细选择，因为mRNA的摄取依赖于巨胞饮，其是未成熟DC的功能，一旦DC成熟则丢失。因此，传统成熟刺激例如脂多糖(LPS)与TAAmRNA的共递送对抗原的生物利用度具有负面影响，抗原的生物利用度是共同决定抗原特异性T细胞应答的诱导的参数(VanLint2012；Diken2011)。迄今为止，已研究了两种不同的策略来用TAAmRNA同时加载DC并在体内激活它们。Fotin-Mleczek等人(2011)描述了含有游离mRNA和与鱼精蛋白复合的mRNA的双组分系统，从而提供用于适应性免疫的抗原来源以及增强的病原体识别受体TLR7的触发。这种免疫策略导致强抗肿瘤免疫应答的诱导和持久的记忆应答，这是重要的，因为记忆T细胞应防止肿瘤的再现。Bonehill等人,2008评估了mRNA的特定组合用于佐剂目的的用途，最初用于活化离体产生的DC，但也同样适用于直接施用和体内摄取(Bonehill，2008)。这已导致了专利申请(WO2009034172)，其中专利技术人描述了抗原性肽脉冲的抗原提呈细胞或用编码TAA的mRNA(共)电穿孔的抗原提呈细胞的T细胞刺激能力可通过对其提供不同的分子佐剂(通过使用编码两种或更多种免疫刺激因子的mRNA或DNA分子的混合物电穿孔)来极大增强。提供的概念证明是这样的用靶特异性肽脉冲的或用编码靶特异性抗原的mRNA共电穿孔的经修饰的抗原提呈细胞在体外和疫苗接种后均能刺激抗原特异性T细胞，从而形成有前景的用于抗肿瘤、抗病毒、抗细菌或抗真菌免疫疗法的新方法。用于该专利技术的免疫刺激因子的优选组合是CD40L和caTLR4，或CD40L和CD70。在其它优选的实施方案中，使用CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激分子的组合，其在下文被称为“TriMix”。本专利技术涉及含有5'翻译增强子序列和3'核保留序列的RNA转录载体。与空pUC载体或者含有翻译增强子或核保留序列的载体相比，根据本专利技术的载体显示了在由体外转录的mRNA编码的蛋白质的表达方面出人意料的改进。这些改进特别地是由于两种组分(翻译增强子和RNA稳定序列)在载体中的同时存在和其在由此得到的表达产物中的并入。此外，获自本专利技术的载体的TriMixmRNA在小鼠癌症模型中的体内应用导致肿瘤生长更慢和所述小鼠预期寿命增加。专利技术概述在第一方面，本专利技术提供了一种核酸载体，其包含与SEQIDN°1具有至少80％序列同一性的翻译增强子(TE)序列、可转录的核酸序列和由SEQIDN°4表示的核保留序列。在具体的实施方案中，可转录的核酸序列选自包含编码CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾病特异性mRNA的列表。在优选的实施方案中，翻译增强子由SEQIDN°1、2或3中的任一种表示，更特别地由SEQIDN°1表示。在其它方面，本专利技术提供了增加体外转录的RNA的稳定性和/或翻译效率的方法；所述方法包括以下步骤：(i)提供根据本专利技术的载体，其中所述可转录的核酸序列是可转录的DNA序列，其对应于待转录的所述RNA；和(ii)体外转录所述可转录的DNA序列。在其它实施方案中，本专利技术提供了一种RNA分子，其包含与SEQIDN°1具有至少80％序列同一性的翻译增强子(TE)、可转录的核酸序列和由SEQIDN°4表示的核保留序列。所述RNA分子可进一步包括多聚-A尾。在本专利技术的RNA分子的上下文中，所述可翻译的核酸序列可选自包含编码CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾病特异性mRNA的列表。在RNA分子的优选的实施方案中，翻译增强子由SEQIDN°1、2或3中的任一种表示；更特别地由SEQIDN°1表示。本专利技术还提供了包含根据本专利技术的一种或多种RNA分子的组合物；更特别地所述一种或多种RNA分子代表编码CD40L、CD70和caTLR4的mRNA分子。根据本专利技术的组合物还可以包含编码抗原/疾病特异性mRNA的mRNA。本专利技术进一步提供了所述RNA分子和/或包含一种或多种所述RNA分子的组合物用于多种目的的用途，诸如例如用于在体内或体外引入宿主细胞中；或用于医学。本专利技术的一个方面还提供包含根据本专利技术的一种或多种载体、一种或多种RNA分子、或组合物的试剂盒。本专利技术还提供了用于使用根据本专利技术的一种或多种RNA分子或组合物治疗有此需要的患者的方法；其中所述RNA分子可以同时或以一定间隔依次施用。根据本专利技术的RNA分子或组合物可以通过任何合适的施用途径(例如结内、皮内、淋巴管内和瘤内)施用至有此需要的患者。此外，当治疗例如癌症患者时，根据本专利技术的RNA分子或组合物的施用可以与用于从患者中的肿瘤释放肿瘤mRNA的方法(例如消融或声致穿孔)组合使用。本专利技术的编号陈述1.一种核酸载体，其包含与SEQIDN°1具有至少80％序列同一性的翻译增强子(TE)序列、可转录的核酸序列和由SEQIDN°4表示的核保留序列。2.权利要求1的核酸载体，其中所述可转录的核酸序列选自包含编码CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗原/疾本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA转录载体，其包含可转录的核酸序列、5'翻译增强子(TE)序列和3'核保留序列(ENE)。/n

【技术特征摘要】
20131112 EP 13192555.41.一种RNA转录载体，其包含可转录的核酸序列、5'翻译增强子(TE)序列和3'核保留序列(ENE)。


2.根据权利要求1所述的RNA转录载体，其中所述TE序列选自包含5'UTR(非翻译区域)中的TOP(末端寡嘧啶段)区域、IRES(内部核糖体进入位点)和上游的ORF(开放阅读框)的列表。


3.根据权利要求2所述的RNA转录载体，其中所述TE序列是被人β珠蛋白5’UTR的9个核苷酸片段间隔的小鼠Gtx同源异形域蛋白的9个核苷酸区段的串联重复序列。


4.根据权利要求3所述的RNA转录载体，其中所述TE序列是通过从人β珠蛋白的5’UTR衍生的9个核苷酸序列(TTCTGACAT)连接来自Gtx前导序列的野生型9个核苷酸序列(CCGGCGGGT)的10×串联重复序列。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的RNA转录载体，其中所述ENE元件是卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的多腺苷酸化的非翻译RNA(PAN)区域的ENE片段；更具体地，所述区域的79个核苷酸序列由具有不对称的内部富含U的环的茎环结构组成。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的RNA转录载体，其中所述可转录的核酸序列选自包含编码CD40L、CD70、caTLR4的mRNA或抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·黑尔曼，K·蒂勒曼斯，
申请(专利权)人：VRIJE布鲁塞尔大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE