聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用技术

本发明专利技术公开了一种聚离子液体改性纳米材料及其制备方法，及该材料在含有磷酸化肽的样品中，富集磷酸化肽的应用。制备方法包括以下步骤：(1)将含有乙烯基修饰的基底材料、乙烯基及机膦酸酯功能化离子液体聚合，得到聚有机膦酸酯离子液体功能化的材料；(2)将聚有机膦酸酯离子液体功能化的材料酸化水解后，再与金属离子结合，得到聚有机膦酸功能化离子液体的亲和材料。本发明专利技术制备的功能化材料易分离，具有更好的亲水性和固定金属离子的能力、耐酸碱性和稳定性，有良好的特异选择性，适合于复杂生物样品的磷酸化肽的富集纯化。该材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
本专利技术属于功能材料领域，具体涉及一种聚离子液体改性纳米材料，同时还涉及该材料的制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用。
技术介绍
1990年启动的人类基因组计划，极大地推动了生命相关学科的发展，导致了1994年蛋白质组学概念的提出。蛋白质组学是研究蛋白质结构特征，表达，修饰以及相关作用等。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰，对蛋白磷酸化-去磷酸化的机制研究，可以为生理过程，发现临床标志物，疾病的发生和发展，以及药物的开发设计提供有价值的信息。质谱技术虽然具有高灵敏性，但直接用于生物样品检测和鉴定磷酸化多肽及磷酸化位点，存在较大困难，难于获得准确信息。主要因为蛋白质磷酸化-去磷酸化是一个动态可逆过程，在生物样品中存在大量的非磷酸化蛋白或肽，低丰度的磷酸化肽信号被严重抑制，难于获得有效真实磷酸化肽的信息。因此，在质谱检测前，磷酸化多肽的高效特异性富集，是获得有效信息必不可少的重要预处理步骤。在配位化学基础上发展起来的IMAC技术(immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)在磷酸化肽富集领域得到广泛应用。通过固定化金属离子与磷酸化肽的磷酸基团特异性结合，可以快速富集磷酸化肽，排除大量非磷酸化的干扰，从而获得磷酸化肽的足够信息。虽然关于IMAC材料研究报道越来越多，大部分工作仍主要集中在对现有材料的模仿和简单修饰。在材料的设计理论和制备方法方面，缺少多学科的交叉渗透，指导理论发展缓慢。现有材料在磷酸化肽富集过程中的特异选择性、富集容量、耐酸碱稳定性、抗干扰性及重复使用性方面，仍不能完全满足从复杂样品中富集磷酸化肽的需要。
技术实现思路
基于现有技术中所存在的问题，本专利技术引入一种新的配体—聚有机膦功能化离子液体(PPFIL)，将有机膦功能化离子液体聚合于基底材料表面，获得一种含高密度膦酸基团的富集材料。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决。本申请中的聚离子液体改性纳米材料，通过以下方法制备：(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。本申请中的聚离子液体改性纳米材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。进一步的，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。进一步的，所述步骤(2)中，反应的温度为75℃，反应时间为2h。进一步的，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。本申请中，聚离子液体改性纳米材料在富集磷酸化肽中的应用：将上述聚离子液体改性纳米材料用于富集磷酸化肽。本专利技术通过在基底材料表面发生聚合作用，得到聚有机膦功能化离子液体修饰的纳米材料，即E-PPFIL；在酸化处理后，继而在有机膦酸酸基团上修饰Ti(Ⅳ)离子，得到E-PPFIL-Ti4+固定金属离子亲和色谱材料。本专利技术通过改变基底材料E，分别选择纳米二氧化硅、二氧化硅包覆磁球纳米颗粒和介孔二氧化硅包覆石墨烯纳米复合材料，制备了三种不同基底材料的IMAC吸附剂，即E-PPFIL-Ti4+(其中，E＝nSiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术的修饰方法简单，易于操作，并且不会破坏基底材料的基本形貌特征，合成材料表面具有高密度的膦酸基团，可以固定高浓度的金属离子。同时，合成的材料易分离，具有良好的稳定性，以及耐酸碱性，增加了该材料的实用性。(2)本专利技术中所合成的固定金属离子亲和材料—E-PPFIL-Ti4+作为IMAC吸附剂，利用金属离子和磷酸化肽中磷酸基团间的亲和性，可应用于磷酸化肽的特异性富集，并且成功地将合成的材料用于标准肽、多肽混合液以及人类唾液中磷酸化肽的富集。附图说明图1为E-PPFIL-Ti4+(以nSiO2-PPFIL-Ti4+为例)的制备流程图。类似地，以Fe3O4@nSiO2、G@mSiO2为基底材料，可以制备得到相应的聚有机膦功能化离子液体修饰的富集材料。图2为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图2a为β-酪蛋白酶解液的直接检测图；图2b为β-酪蛋白酶解液经过nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2c为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2d为β-酪蛋白酶解液经过G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。图3为β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：1000)的质谱图；其中，图3a为nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图3b为Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图3c为G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。图4为β-酪蛋白(1.43pmol)和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：15000)在G@mSiO2-PPFIL-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.聚离子液体改性纳米材料，其特征在于，所述的材料通过以下方法制备：/n(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH

【技术特征摘要】
1.聚离子液体改性纳米材料，其特征在于，所述的材料通过以下方法制备：
(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；
(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；
(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。


2.聚离子液体改性纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌斌，梁洪泽，蒋雨菲，梁炜达，刘彬，蒋银丽，卢俐衡，林嘉宇，桑坤明，黎思蕴，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33