一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法技术

本发明专利技术公开了一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，具体涉及生物医学技术领域，包括如下步骤：根据标本配制介质；心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。本发明专利技术提供的测定方法，不需要提取线粒体，只需分离少量的肌肉组织，通过透化操作和底物抑制剂滴定分析即可实现最大程度接近线粒体的生理状态的功能评估。

【技术实现步骤摘要】
一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法。
技术介绍
目前，线粒体功能与疾病是当前生物医学领域最前沿之一。线粒体普遍存在于真核细胞，是进行能量转化的主要细胞器，也是细胞凋亡调控和活性氧产生的重要部位。线粒体功能障碍特别是氧化磷酸化缺陷将导致一系列临床表现多样性疾病即线粒体疾病。1962年Luft等报道了因线粒体电子传递和ATP合成之间耦联松散导致代谢亢进的病例，第一次将线粒体功能与人类疾病联系在一起。随后，在多种脑肌病患者中发现呼吸链功能缺陷和线粒体形态畸变。1995年Bourgeron等报道了第一例因核基因编码的氧化磷酸化亚单位基因突变导致Leigh综合征(Leighsyndrome，LS)及复合物II缺陷病例。线粒体呼吸链酶学分析对于诊断线粒体疾病和研究细胞能量代谢、细胞凋亡机制都是至关重要的。但由于需要新鲜足量的标本和复杂的实验室技术支持，国内尚未建立起临床实用的呼吸链复合物酶活性测定方法，以Leigh综合征为例，由于缺乏线粒体呼吸链酶活性分析方法，迄今国内仅30.8％的患者获得生化和基因诊断，多数病因不明。鉴于此，检测线粒体呼吸链功能方法的建立对于诊断线粒体疾病是必要的，其中，线粒体呼吸链酶复合物活性分析是关键技术。传统的评价线粒体功能的方法是通过提取分离，测定单个呼吸链线粒体酶活性。单个呼吸链线粒体酶的活性测定广泛应用于评价线粒体功能和功能障碍。但由于这种方法不能揭示复合酶如何相互作用，因而不能预测线粒体损伤。氧化磷酸化必须在未受损的线粒体中，通过测量线粒体的耗氧量实现。线粒体分离的过程建立在对组织或细胞的不同离心作用上，这种操作导致了对线粒体功能性质的体外设计。尽管该法有很多优点，如评价线粒体功能的完整性、氧化磷酸化能力和线粒体蛋白的输入等，该法也有一些缺点：线粒体性质容易受到分离步骤的影响，该效应在病理损伤的线粒体中表现更为显著；容易导致对某一特种线粒体群的优先选择，肿胀的线粒体密度下降，导致离心时可能优选未受损伤的线粒体，而病理线粒体相比最初的标本含量可能会明显下降；需要大量细胞(200×106个)或组织(湿重500mg以上)，以分离出高质量的线粒体；在分离的线粒体中，正常线粒体的相互作用受到破坏，据报道，这些反应对于代谢通道、内部能量转换等至关重要。正因如此，线粒体功能的体内和体外表现才大相径庭；另外会损伤生理线粒体、影响线粒体呼吸系统的装配结果和细胞器内外相互作用等，造成极大的人为误差。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，包括如下步骤：S1，根据标本配制介质；S2，心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；S3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；S4，利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；S5，利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；S6，对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。其中，所述介质包括：活检保存液：BIOPS溶液；透化试剂：皂苷、皂苷透化液；呼吸介质：MIR06；底物：ADP、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、TMPD和抗坏血酸盐；复合物抑制剂：鱼藤酮、抗霉素A、苍术苷复合物抑制剂；测试介质：细胞色素C。其中，心肌透化制备,包括：S21，获取心肌并去除所有脂肪和结缔组织，将所述心肌分离成肌条，浸泡在BIOPS溶液中；S22，对浸在BIOPS溶液的肌条进行分离，获取肌纤维束；S23，将肌纤维束转移到含有BIOPS溶液的透化试剂中，在0℃至4℃条件下温和混匀10-30分钟；S24,将混匀后的肌纤维转移到含有线粒体呼吸介质中，温和震荡5分钟，洗去皂苷和ATP，洗掉皂苷和其他代谢物后称量肌纤维束的湿重；S25，在高分辨率呼吸测定仪反应仓中加入呼吸介质2.1ml，在37℃条件下与空气平衡；S26，将透化并称重后的肌纤维束加到所述反应仓中。其中，心肌细胞的透化制备，包括：获取心肌细胞；用胰蛋白酶清洗所述细胞，离心；计算细胞密度，测试细胞活性；利用MIR06清洗所述心肌细胞，离心，将细胞在呼吸介质中再混悬；在高分辨率呼吸测定仪反应仓加入呼吸介质1ml至3ml，在36℃至38℃条件下与空气平衡；将所述细胞混悬液加入到所述反应仓中进行稀释，系统平衡4至6分钟；对稀释后的细胞混悬液加入洋地黄皂苷digitonin，进行培养，使呼吸速率降低5-7分钟。其中，对线粒体复合物的逐步分析，包括：分别加入10mM谷氨酸和5mM苹果酸各5μL，记录静止的复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ支持的呼吸；加入10μM细胞色素C1μL，保证线粒体的呼吸强度；加入0.5M的ADP10μL，获得复合物Ⅰ最大呼吸速率；加入10mM琥珀酸20μL，获得复合物Ⅰ+Ⅱ的呼吸速率；加入0.5μM鱼藤酮复合物Ⅰ的抑制剂1μL，获得复合物Ⅱ的呼吸速率；加入2.5μM抗霉素A复合物Ⅲ的抑制剂1μL；分别加入0.5mM的TMPD和2mM抗坏血酸盐各5μL，激活复合物Ⅳ。其中，所述心肌分离出的肌条长2mm-5mm，直径1mm，湿重2mg-5mg。其中，所述获取的心肌细胞为(5-10)×106个。其中，所述胰蛋白酶清洗在36℃-38℃下进行，时间为4-6分钟，所述胰蛋白酶的浓度为0.5％。本专利技术的优点：本专利技术提供了一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，与传统线粒体呼吸链复合物活性对比，传统线粒体呼吸链复合物活性常在体外分离线粒体后再检测其功能，然而，线粒体的重要性质在体内和体外的表现是不同的。近年来随着高分辨率呼吸仪的出现，国外体外线粒体检测方法有了很大的改进，但仍停留在实验室水平。本专利技术应用高分辨率呼吸测定仪通过原位法检测心肌、培养心肌、心肌细胞的线粒体呼吸功能，本专利技术不需要分离细胞器、只需应用洋地黄毒苷或皂苷等透化剂对标本进行选择性的透化后，再运行设计的底物-抑制剂滴定方法便可实现对几种线粒体复合物的逐步分析。本专利技术可保留在细胞内原位置和装配条件下的线粒体功能特征，保留与其他细胞器的交互作用。由于仅需少量组织，且所有透化过程和特别的滴定分析可在2小时内完成，该方案可期待用于人类活检样品的氧化磷酸化研究和临床病理诊断，为人类线粒体病理和生理学临床诊断和研究提供科学依据。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本专利技术还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本专利技术作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1是本专利技术的数据采集与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1，根据标本配制介质；/nS2，心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；/nS3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；/nS4，利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；/nS5，利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；/nS6，对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。/n

【技术特征摘要】
1.一种肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，根据标本配制介质；
S2，心肌的透化制备，以及心肌细胞的透化制备；
S3，利用所述介质对线粒体外膜进行完整性测试，检验线粒体外膜的损伤程度，并重塑损伤线粒体外膜的电子传递；
S4，利用呼吸控制率RCR评价，对标本的透化质量测试；
S5，利用呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的底物抑制剂滴定分析，对线粒体复合物进行逐步分析；
S6，对分析的数据进行采集与分析，得到心肌渗透性纤维的高分辨率呼吸测定。


2.根据权利要求1所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法,其特征在于，所述介质包括：
活检保存液：BIOPS溶液；
透化试剂：皂苷、皂苷透化液；
呼吸介质：MIR06；
底物：ADP、谷氨酸、苹果酸、琥珀酸、TMPD和抗坏血酸盐；
复合物抑制剂：鱼藤酮、抗霉素A、苍术苷复合物抑制剂；
测试介质：细胞色素C。


3.根据权利要求2所述的肌肉组织的线粒体呼吸功能原位测定方法，其特征在于，心肌透化制备,包括：
S21，获取心肌并去除所有脂肪和结缔组织，将所述心肌分离成肌条，浸泡在BIOPS溶液中；
S22，对浸在BIOPS溶液的肌条进行分离，获取肌纤维束；
S23，将肌纤维束转移到含有BIOPS溶液的透化试剂中，在0℃至4℃条件下温和混匀10-30分钟；
S24,将混匀后的肌纤维转移到含有线粒体呼吸介质中，温和震荡5分钟，洗去皂苷和ATP，洗掉皂苷和其他代谢物后称量肌纤维束的湿重；
S25，在高分辨率呼吸测定仪反应仓中加入呼吸介质2.1ml，在37℃条件下与空气平衡；
S26，将透化并称重后的肌纤维束加到所述反应仓中。


4.根据权利要求2所述的肌肉组织的线粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹雪滨，平政，徐鹏，王冬颖，王晨阳，黄河玲，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军第八十二集团军医院，
类型：发明
国别省市：河北;13