一种复方中药免疫脂质体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及中药复方制剂领域，具体是一种由抗体、脂质原料和中药单体蟾毒灵、蜂毒素自组装的复方中药免疫脂质体及其制备方法和应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术以蟾毒灵、蜂毒素、抗体以及脂质原料作为基本材料，制备出一种既具有抗体主动靶向又可以同时负载具有溶血和亲水性的蜂毒素和疏水性的蟾毒灵的复方中药免疫脂质体，其可以利用肿瘤组织的EPR效应实现药物在肿瘤内的富集。

【技术实现步骤摘要】
一种复方中药免疫脂质体及其制备方法和应用
本专利技术涉及中药复方制剂领域，具体地说，是一种复方中药免疫脂质体及其制备方法和应用。
技术介绍
原发性肝癌是受到全球关注的重大癌症之一，在全球肿瘤相关原因死亡中位列第3位。在我国，原发性肝癌的发病率在各类肿瘤中排第4位，死亡率位列第3位，新发病例和死亡病例数量均占全球总数的一半以上，是一个肝癌大国。目前，肝癌的治疗手段有肝移植、肝癌切除术、肝动脉化疗栓塞术、立体定向放疗、射频消融术及分子靶向治疗等。大多数肝癌患者在诊断时已经处于中晚期，手术切除仅是不到20％患者的选择。索拉非尼(Sorafenib)是美国FDA推荐的用于肝癌的分子靶向一线治疗药物，主要用于中晚期肝癌患者的治疗。然而，临床研究结果显示，与对照组比较，索拉非尼仅能延长约3个月的中位生存时间(7.9个月vs10.7个月；P<0.001)，仅对30％患者有效，且有手足综合征、腹泻等诸多副作用。此外，索拉非尼还容易出现耐药，获得性耐药通常在6个月内发生。在我国，中医药在肝细胞癌的治疗中发挥着极为重要的作用，具有增效减毒、调节免疫力、防治肝癌复发转移等作用，有效改善肝细胞癌患者的临床症状、提高生活质量。蟾酥是中华大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑框蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)耳后腺及表皮腺体的分泌物，呈白色乳状液体或浅黄色浆液。《本草汇言》认为蟾酥能“化解一切瘀郁壅滞诸疾，如积毒、积块、积胀、内疔痈肿之证，有攻毒拔毒之功”，《本草纲目》则记载蟾酥能“治一切恶肿”，是中医临床上重要的抗肿瘤药物。现代研究表明，中药蟾酥中的重要活性成分之一蟾毒灵(Bufalin)具有较强的抗肝癌生长及转移的作用，可以调节线粒体这一细胞内“能量供应站”及肿瘤转移“加速器”如PI3K/Akt信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等环节。此外，蟾毒灵可以通过内质网应激促进肝癌细胞的凋亡，内质网应激特别是PERK/eIF2α/CHOP通路参与了蟾毒灵诱导的自噬反应，通过AMPK/mTOR/p70S6K-4EBP-1通路诱导肝癌细胞的自噬，并作用于细胞核，干扰其转录调控。蜂毒素(Melittin)，又名蜂毒肽，由Habermann等最早从欧洲蜜蜂(ApisMellifera)的毒液中分离出来，占蜂毒干重的50％以上，由26个氨基酸(H-Gly-Ile-G1y-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Tyr-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gin-Gin-NH2)组成，主要通过直接抑制细胞运动分子Rac1信号通路、VEGF信号通路等肿瘤侵袭的作用。但是关于蜂毒素和蟾毒灵联合应用提高抗肝癌转移疗效，发挥协同抗肝癌转移作用目前还未见报道。
技术实现思路
蜂毒素和蟾毒灵能通过不同的机制发挥良好的抗肝癌作用，两者的联合应用有望提高抗肝癌转移疗效，发挥协同抗肝癌转移作用。两者联合应用，需要解决两个关键性技术问题。首先，蜂毒素强烈的溶血副作用极大地限制了其应用。由于蜂毒素分子结构中没有羧基，且含有3个赖氨酸和2个精氨酸残基，使其成为一种强碱性肽(pH＝10)，具有较强的溶血副作用。其次，蟾毒灵的水溶性较低限制了其生物利用。蟾毒灵水溶性差、毒性强、半衰期短限制了其临床应用。在治疗肿瘤的纳米载药体系中，脂质体在肿瘤纳米靶向给药领域扮演了重要角色。较之于其它纳米载体，脂质体的优势主要集中在4个方面：(1)可以同时负载亲水性药物和疏水性药物，其疏水的磷脂双分子层可包裹疏水的蟾毒灵，而亲水性的内囊区域则可包裹亲水性的蜂毒素；(2)可改变药物的药代动力学特征，延长作用时间，提高其疗效；(3)生物相容性良好，安全性能较佳；(4)可修饰性较强，容易实现靶向性。脂质体可以透过血管壁进入肿瘤组织，并在其中蓄积。本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种由抗体、脂质原料和中药单体蟾毒灵、蜂毒素自组装的复方中药免疫脂质体。本专利技术的第二个目的是，提供所述的复方中药免疫脂质体的制备方法。本专利技术的第三个目的是，提供所述的复方中药免疫脂质体在制备肝癌治疗药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术的第一方面，提供一种复方中药免疫脂质体，是由巯基化的抗体、Mal-PEG2000-DSPE与蟾毒灵和蜂毒素在液相环境中自组装形成的，具有如下的结构：mAb-Mal-PEG2000-DSPE-[(Bufalin)m-(Melittin)n]脂质体其中，mAb为单克隆抗体，Mal-PEG2000-DSPE为马来酰亚胺-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺，Bufalin为蟾毒灵，Melittin为蜂毒素，m和n分别为偶联上的蟾毒灵和蜂毒素的分子数目，n值为1-80，m为1-16；所述脂质体为球状双层脂质结构，疏水性的蟾毒灵包裹在疏水的外层脂质层中，亲水性蜂毒素包裹在亲水的脂质体内囊中，单克隆抗体则与Mal-PEG2000-DSPE链接在最外层；所述每个脂质体中蟾毒灵和蜂毒素的分子数目为1-10000(优选蟾毒灵和蜂毒素分别是1-1000和1-5000)。进一步的，所述的脂质体中mAb和Mal-PEG2000-DSPE的摩尔比为1:10。进一步的，所述的脂质体中蟾毒灵和蜂毒素的摩尔比(m:n的比例)为1:5。进一步的，所述单克隆抗体为Her1、Her2、CD20或CD40；优选为Her1。进一步的，所述脂质体粒径大小为119.73±7.69nm。本专利技术的第二方面，提供一种如上所述的复方中药免疫脂质体的制备方法，是采用薄膜分散法制备，选择氯仿为有机相溶剂，油水比1:2，使得药物和脂质体原料自组装成脂质体结构；包括以下步骤：首先，将蟾毒灵、胆固醇、DOPC、DSPC、Mal-PEG2000-DSPE、维生素E，溶于氯仿后，利用旋转蒸发法制备脂质薄膜；其次，将溶解有蜂毒素的PBS与脂质薄膜进行混匀水浴并超声；接着，利用脂质体均质仪和聚碳酸酯膜(核打孔)对脂质体的粒径进行控制，将部分多室脂质体加压挤出为单室脂质体；最后，将挤压后的脂质体和巯基化抗体混合后，在室温下避光孵育2h，从而制备出，外壳连有亲水性抗体的复方中药免疫脂质体。进一步的，所述的制备方法包括以下步骤：(A)将蟾毒灵、胆固醇、DOPC、DSPC、Mal-PEG2000-DSPE、维生素E，溶于氯仿后，室温下避光搅拌反应2h；(B)旋转蒸发除去氯仿(通氮气)，使成膜材料在圆底烧瓶底部形成一层均匀薄膜；所述旋转蒸发的优选条件为：转速40rpm，温度37℃，旋转蒸发时间为12h，氮气流速为10mL/min；(C)圆底烧瓶中加入含有蜂毒素的水合介质后，混匀水浴并超声，即得复方中药脂质体；所述水合的优选条件为：油水比1:2，超声时间20min，水合温度45℃，水合时间40min；(D)选用脂质体均质仪和聚碳酸酯膜(核打孔)来对脂质体的粒径进行控制，将粒径控本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种复方中药免疫脂质体，其特征在于，是由巯基化的抗体、Mal-PEG

【技术特征摘要】
1.一种复方中药免疫脂质体，其特征在于，是由巯基化的抗体、Mal-PEG2000-DSPE与蟾毒灵和蜂毒素在液相环境中自组装形成的，具有如下的结构：
mAb-Mal-PEG2000-DSPE-[(Bufalin)m-(Melittin)n]脂质体
其中，mAb为单克隆抗体Her1、Her2、CD20或CD40；Mal-PEG2000-DSPE为马来酰亚胺-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺，Bufalin为蟾毒灵，Melittin为蜂毒素，m和n分别为偶联上的蟾毒灵和蜂毒素的分子数目，n值为1-80，m为1-16；所述脂质体为球状双层脂质结构，疏水性的蟾毒灵包裹在疏水的外层脂质层中，亲水性蜂毒素包裹在亲水的脂质体内囊中，单克隆抗体则与Mal-PEG2000-DSPE链接在最外层；所述每个脂质体中蟾毒灵和蜂毒素的分子数目为1-10000。


2.根据权利要求1所述的复方中药免疫脂质体，其特征在于，所述的脂质体中mAb和Mal-PEG2000-DSPE的摩尔比为1:10。


3.根据权利要求1所述的复方中药免疫脂质体，其特征在于，所述的脂质体中蟾毒灵和蜂毒素的摩尔比为1:5。


4.根据权利要求1所述的复方中药免疫脂质体，其特征在于，所述脂质体粒径大小为20-1000nm。


5.一种如权利要求1-4任一所述的复方中药免疫脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先，将蟾毒灵、胆固醇、DOPC、DSPC、Mal-PEG2000-DSPE、维生素E，溶于氯仿后，利用旋转蒸发法制备脂质薄膜；其次，将溶解有蜂毒素的PBS与脂质薄膜进行混匀水浴并超声；接着，利用脂质...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄念，凌昌全，李威，王丽娜，杜娟，何煜宇，干正，王曼，阮亦，贺海威，苟浩，董霞，陶万茹，黄勇，
申请(专利权)人：上海长海医院，
类型：发明
国别省市：上海;31