一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途，所述地西他滨能够提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例；能够提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量；能够提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达；能够明显控制小鼠炎性肠病的结肠病变。本发明专利技术的地西他滨可诱导炎性肠病患者对肠道非致病性抗原的免疫耐受、恢复肠屏障功能，提高有效率及缓解率，降低复发率。

【技术实现步骤摘要】
一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。
技术介绍
炎症性肠病通常指病因尚不清楚的非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。既往该病在欧美国家较为多见，但随着近年来国内各家医院报道病例数的显著增多，炎症性肠病已成为我国一种较常见的消化道疾病。炎症性肠病的病因尚未明确，考虑与遗传因素、环境因素、免疫缺陷及微生物暴露等有关。目前治疗炎症性肠病的常用药物为柳氮磺吡啶和英孚利昔单抗，柳氮磺吡啶治疗炎性肠病有效率50~70%，缓解率40~60%，复发率15~30%；而英孚利昔单抗则价格高昂。炎性肠病的病理过程系由肠道免疫系统对肠道非致病性抗原的反复免疫激活所致，其中调节性T细胞(Treg)在抑制免疫反应、介导免疫耐受等过程中起重要作用。Treg细胞在体内仅占外周CD4+T细胞的5％～10％，绝对数量少，必须通过人工手段诱导扩增达一定数量后方可成功诱导免疫耐受。转录因子Foxp3特异性高表达是Treg细胞发育和功能的决定因素，而Foxp3基因的表达受其启动子区上游的CPG模体甲基化程度调节，CPG模体甲基化程度越低，Foxp3基因表达程度越高，相应的Treg细胞数量也越多。地西他滨（5-aza-2’-deoxycytidine，5AZA)为嘧啶核苷类似物，在DNA复制过程中，可以与细胞内DNA甲基转移酶结合形成共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而达到去甲基化，使因甲基化而失活的基因重新表达，恢复基因的功能，促使细胞的转化，临床上已被批准用于对骨髓增生异常综合征等血液系统疾病的治疗。
技术实现思路
本专利技术针对现有柳氮磺吡啶和英孚利昔单抗在治疗炎性肠病中所存在的问题，所提出的一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。本专利技术是按照以下技术方案实现的。一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例。进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量。进一步的，地西他滨提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达。进一步的，地西他滨明显控制小鼠炎性肠病的结肠病变。本专利技术获得了如下有益效果：本专利技术利用地西他滨的去甲基化作用，降低Foxp3基因启动子区上游的CPG模体甲基化程度，促进Foxp3表达，体内扩增Treg细胞，诱导肠道免疫系统对肠道非致病性抗原的免疫耐受，从而治疗炎性肠病，有效率及缓解率高、复发率低，且成本相对低廉，具有广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术流式细胞术检测结果图；图2是本专利技术ELISA法测定小鼠结肠组织THl7/Treg相关细胞因子IL-17和TGF-β、IL-10水平变化图；图3是本专利技术免疫荧光法定位紧密连接蛋白的表达图；图4是本专利技术小鼠疾病活动指数、结肠大体形态损伤指数、结肠病理组织学指数评分结果图；图5是本专利技术地西他滨治疗炎症性肠病的作用原理图。具体实施方式为了进一步阐释本专利技术的技术方案及其所实现的技术效果，下面将结合附图及实施例对本专利技术进行进一步的说明。造模与治疗：予3%葡聚糖硫酸钠口服7天制备小鼠炎性肠病模型，分为DSS、SASP、5AZA三组，分别予以生理盐水、柳氮磺吡啶(100mg/kg体重)、地西他滨(0.5mg/kg体重)一天两次腹腔注射，连续治疗7天。实施例1切取小鼠脾脏，以PBS为匀浆介质研磨粉碎，经70um尼龙网过滤，1500rpm离心5min，去上清液，沉淀中加入2ml0.83%NH4CL裂解红细胞，2min后加入15mlPBS终止裂解作用，1500rpm离心5min，去上清液，沉淀中加入1mlPBS，计数，调整细胞密度至106/ml，加入24孔板，1ml/wall。加入相应浓度的抗CD3抗体（0.5μg/ml）、抗CD28抗体（1μg/ml），设三个复孔，并设PBS阴性对照孔，于5%CO2、37℃培养72小时，PBS洗涤2次后，加入0.05μg/μlAPC-Ratanti-mouseCD4抗体50μl，4℃避光染色30min，PBS洗涤2次，加入1ml3：1稀释的破膜固定液，4℃避光放置1h；加入2ml破膜液，离心洗2次；重悬至100μl，加入PE-Ratanti-mouseFoxp3抗体，4℃避光孵育1h，加入2ml破膜液，离心洗涤，加入200μl的PBS用流式细胞仪检测细胞，流式数据使用Flowjo（ThreeStar）软件分析。实验结果显示（图1）：地西他滨（5AZA）提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。实施例2ELISA法测定小鼠结肠组织THl7/Treg相关细胞因子IL-17和TGF-β、IL-10水平变化：将结肠组织放在冰的PBS上冲洗，滤纸拭干后称取约10mg结肠组织，加入lmLPBS(pH:6.0，内含1μg抑肽酶和亮肽素胃酶抑素A)，用眼科剪剪碎后放人匀浆器进行匀浆，4℃，12000r/min离心20min，取上清液，按ELISA试剂盒说明书检测IL-17和TGF-β、IL-10的浓度。实验结果显示（图2）：地西他滨(5AZA)提高炎症性肠病小鼠结肠组织中调节性T细胞相关细胞因子含量，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。实施例3免疫荧光法定位紧密连接蛋白的表达：将小鼠新鲜结肠组织经PBS冲洗后用组织包埋剂包埋(Sakura，USA)，并置于-80℃保存。将冰冻组织10μm切片后在95℃10mmol/L枸橼酸钠溶液中孵育5min，冷却至室温。用含有5％牛血清白蛋白和5％胎牛血清的PBS室温下孵育30min以消除非特异性背景。将以上切片与紧密连接蛋白ZO-1、Occludin一抗在4℃下孵育过夜，用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽室温下染色1h，再经相应荧光素标记的二抗孵育后，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白定位。实验结果显示（图3）：地西他滨(5AZA)提高炎症性肠病小鼠结肠组织紧密连接蛋白的表达，效果优于柳氮磺吡啶（SASP）。实施例4小鼠疾病活动指数、结肠大体形态损伤指数、结肠病理组织学指数评分：小鼠疾病活动指数(DAI)观察及评分:根据相关标准行小鼠DAI评分:观察小鼠的精神状态，大便的性质，有无血便，每天记录小鼠的的体重变化情况。0分：大便性质正常，无血便及隐血便，体重无下降；1分：大便松散，隐血便阳性弱阳性，体重下降>0～5％；2分：大便松散，隐血阳性，体重下降>5％～10％；3分：呈稀便，肉眼血便，体重下降>10％～15％；4分：呈稀便。大量肉眼血便．体重下降>15％。DAI评分=大便性质评分+血便评分+体重变化评分。小鼠结肠大体形态损伤指数(CHDI)观察及评分:造模后第7d处死小鼠后，取全段结肠组织在解剖显微镜下观察溃疡及炎症情况，根据Wallace等标准进行评分：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。/n

【技术特征摘要】
1.一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途。


2.根据权利要求1所述的一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途，其特征在于：地西他滨提高炎症性肠病小鼠脾脏调节性T细胞比例。


3.根据权利要求1所述的一种地西他滨在制备治疗炎症性肠病药物中的用途，其特征在于：地西他滨提高炎症性肠病小鼠结肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏畅，曹奕鸥，茅安炜，饶龙华，
申请(专利权)人：上海市闵行区中心医院，
类型：发明
国别省市：上海;31