一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法技术

一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，采集芍药幼嫩部位进行低温处理；低温处理后的芍药外植体使用洗洁精浸泡后流水冲洗；冲洗完毕后的芍药外植体，浸泡在多菌灵和青霉素钠混合溶液中并置于摇床；浸泡后的芍药外植体由75％酒精消毒，再以0.1％升汞消毒进行表面消毒；消毒后的芍药外植体在含有益培灵的培养基中培养；本发明专利技术能有效降低芍药组织培养中的污染，且芍药外植体存活率较高，实用性、推广性强。

【技术实现步骤摘要】
一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法
本专利技术涉及到组织培养
，具体为一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法。
技术介绍
芍药(PaeonialactiflorPall.)为芍药科芍药属，多年生草本植物，是我国著名的观赏、药用植物。但芍药的传统繁殖方式生产周期长繁殖系数低，严重影响了芍药的规模化生产。组织培养技术是目前植物快繁的有效方法之一，具有繁殖周期短，繁殖系数高等优势。但芍药自身携带内生菌，用常规的消毒方法难以控制其内生菌污染，培养初期出现大量细菌和真菌污染，严重制约了芍药组织培养的发展。因此，研究一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法成为目前迫切需要解决的技术难题。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法。为达到上述目的，本专利技术提供了一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，包括以下步骤：(1)采集芍药幼嫩部位进行低温处理；(2)低温处理后的芍药外植体使用洗洁精浸泡后流水冲洗；(3)冲洗完毕后的芍药外植体，浸泡在多菌灵和青霉素钠混合溶液中并置于摇床；(4)浸泡后的芍药外植体由75％酒精消毒，再以0.1％升汞消毒进行表面消毒；(5)消毒后的芍药外植体在含有益培灵的培养基中培养。优选的，所述步骤1低温处理为将新采集的芍药外植体用锡箔纸包裹置于4℃冰箱中，低温处理24-48h。优选的，所述步骤2芍药外植体由稀释洗洁精浸泡20min，清洗外表的泥沙后流水冲洗芍药外植体1h。优选的，所述步骤3将芍药外植体浸泡在浓度为3-5g/L的多菌灵和浓度为0.5-1.5g/L青霉素钠混合溶液的培养瓶中，置于摇床，振荡速度为1601/min，振荡时间为1h，然后用无菌蒸馏水清洗三次。将培养瓶外部喷洒75％酒精，放入超净工作台中，大风吹20min。优选的，所述步骤4在超净工作台上，用75％酒精消毒10s，无菌蒸馏水清洗3次，0.1％升汞消毒7-8min，无菌蒸馏水清洗8-10次。优选的，所述步骤5将芍药外植体切为适宜大小，接入到含有益培灵的培养基中，22-25℃下黑暗培养一周。优选的，所述培养基为：MS+蔗糖30g/L+TDZ2.5mg/L+琼脂粉7.5g/L+益培灵0.1-0.2g/L，培养基pH值调至5.8-6.0，将配制好的培养基装入培养瓶中，121℃高温灭菌25min。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：1、本专利技术从加强芍药外植体的表面消毒和培养过程中抑制内生菌污染两个方面入手，有效降低芍药组织培养过程中的外植体的污染；2、在前期经多菌灵处理后的芍药外植体培养过程中几乎不出现真菌污染；青霉素钠处理后，能够抑制一部分芍药内生菌；3、多菌灵和青霉素钠混合溶液处理时置于摇床，可以加强混合溶液的杀菌效果；4、在组织培养过程中内生菌是持续出现的，培养基中添加益培灵能够有效地减少芍药组织培养过程中的内生菌污染；且经过这一系列的消毒处理后，外植体存活率较高。5、常规消毒处理只能消除芍药外植体表面的的微生物，难以抑制芍药的内生菌生长，在培养3-4d胡出现大量的内生菌污染，造成材料的浪费，难以进行下一步试验。本方法处理对芍药外植体的伤害较小，经本方法处理后芍药叶片能成功诱导形成愈伤组织，而带芽茎段能成功诱导形成带芽点的愈伤且能成功分化形成不定芽，幼苗生长健康，可用于进一步研究。附图说明图1为常规消毒方法(对照)处理后组织培养图；图2为本方法处理后组织培养图；具体实施方案下面结合说明书附图对本专利技术技术方案做进一步详细描述：一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，包括以下步骤：(1)采集生长健康的芍药幼嫩部位进行低温处理；(2)低温处理后的芍药外植体使用洗洁精浸泡后流水冲洗；(3)冲洗完毕后的芍药外植体，浸泡在多菌灵和青霉素钠混合溶液中并置于摇床；(4)浸泡后的芍药外植体由75％酒精消毒，再以0.1％升汞消毒进行表面消毒；(5)消毒后的芍药外植体在含有益培灵的培养基中培养。优选的，所述步骤1低温处理为将新采集生长健壮的芍药外植体用锡箔纸包裹置于4℃冰箱中，低温处理24-48h。优选的，所述步骤2芍药外植体由稀释洗洁精浸泡20min，用软毛刷子清洗外表的泥沙后流水冲洗芍药外植体1h，流水大小足以将芍药外植体冲起翻滚。优选的，所述步骤3将芍药外植体浸泡在浓度为3-5g/L的多菌灵和浓度为0.5-1.5g/L青霉素钠混合溶液的培养瓶中，置于摇床，振荡速度为1601/min，振荡时间为1h，然后用无菌蒸馏水清洗三次。将培养瓶外部喷洒75％酒精，放入超净工作台中，大风吹20min。优选的，所述步骤4在超净工作台上，用75％酒精消毒10s，无菌蒸馏水清洗3次，0.1％升汞消毒7-8min，无菌蒸馏水清洗8-10次。优选的，所述步骤5将芍药外植体切为适宜大小，接入到含有益培灵的培养基中，22-25℃下黑暗培养一周。优选的，所述培养基为：MS+蔗糖30g/L+TDZ2.5mg/L+琼脂粉7.5g/L+益培灵0.1-0.2g/L，培养基pH值调至5.8-6.0，将配制好的培养基装入培养瓶中，121℃高温灭菌25min。实施例1一种降低芍药组织培养中的外植体污染方法，其具体步骤如下：(1)采取芍药带芽茎段，用锡箔纸包裹放入4℃冰箱中，低温处理24-48h；(2)低温处理后的芍药带芽茎段用稀释的洗洁精浸泡20min，用毛刷将芍药带芽茎段表面泥沙清洗干净，在自来水下冲洗，自来水的不宜过大，也不宜过小，将芍药带芽茎段冲起在水翻滚为宜，流水冲洗1h；(3)将冲洗干净的芍药带芽茎段放入装有多菌灵浓度为5g/L和青霉素钠浓度为1g/L的混合溶液的培养瓶中，置于摇床，振荡速度为1601/min，振荡时间为1h，然后用无菌蒸馏水清洗三次。将培养瓶外部喷洒75％酒精，放入超净工作台中，大风吹20min；(4)在超净工作台上，用75％酒精消毒10s，无菌蒸馏水清洗3次，0.1％升汞消毒8min，无菌蒸馏水清洗8-10次；(5)将芍药带芽茎段切为适宜大小接入到含有益培灵的培养基中。22-25℃下黑暗培养一周后观察污染情况；培养基为MS+蔗糖30g/L+TDZ2.5mg/L+琼脂粉7.5g/L+益培灵0.15g/L，培养基pH值调至5.8-6.0，配制好的培养基装入培养瓶中，121℃高温灭菌25min；(5)在温度22-25℃下暗培养一周后，芍药组织培养的中污染率为33.33％，存活率为55.6％，如图2所示。实施例2一种降低芍药组织培养中的外植体污染方法，其具体步骤如下：(1)采取芍药幼嫩叶片，用锡箔纸包裹放入4℃冰箱中，低温处理24-48h；(2)低温处理后的芍药叶片用稀释的洗洁精浸泡20min，用毛刷将叶片表面泥沙清洗干净，在自来水下冲洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)采集芍药幼嫩部位进行低温处理；/n(2)低温处理后的芍药外植体使用洗洁精浸泡后流水冲洗；/n(3)冲洗完毕后的芍药外植体，浸泡在多菌灵和青霉素钠混合溶液中并置于摇床；/n(4)浸泡后的芍药外植体由75％酒精消毒，再以0.1％升汞消毒进行表面消毒；/n(5)消毒后的芍药外植体在含有益培灵的培养基中培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集芍药幼嫩部位进行低温处理；
(2)低温处理后的芍药外植体使用洗洁精浸泡后流水冲洗；
(3)冲洗完毕后的芍药外植体，浸泡在多菌灵和青霉素钠混合溶液中并置于摇床；
(4)浸泡后的芍药外植体由75％酒精消毒，再以0.1％升汞消毒进行表面消毒；
(5)消毒后的芍药外植体在含有益培灵的培养基中培养。


2.根据权利要求1所诉的一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，其特征在于，所述步骤1低温处理为将新采集的芍药外植体用锡箔纸包裹置于4℃冰箱中，低温处理24-48h。


3.根据权利要求1所诉的一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，其特征在于，所述步骤2芍药外植体由稀释洗洁精浸泡20min，清洗外表的泥沙后流水冲洗芍药外植体1h。


4.根据权利要求1所诉的一种降低芍药组织培养中外植体污染的方法，其特征在于，所述步骤3将芍药外植体浸泡在浓度为3-5g...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利，敖青霞，姜媛媛，赵茂俊，倪苏，王龙，胡佳，冯均，周劲，余燕，王海平，吴金勇，陈欢，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51