检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法，其中所述检测白细胞线粒体呼吸功能的方法可以包括白细胞的提取(S1)，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；接种所述白细胞(S2)，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及线粒体呼吸功能的检测(S3)，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。根据本发明专利技术的方法，能够检测完整细胞状态下的线粒体功能，能够对细胞能量代谢过程进行实时监测。

【技术实现步骤摘要】
检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及检测肾阴虚症的方法
本专利技术总体涉及生物
，更具体地，涉及一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及使用该方法检测肾阴虚症实验动物的方法。
技术介绍
线粒体是机体能量产生的重要场所，细胞内90％以上的ATP都由线粒体提供。研究表明，多种人类慢性疾病(如肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病)的发生与细胞能量代谢异常密切相关。因此，研究线粒体功能，并对细胞能量代谢过程进行实时监测，对于临床疾病诊断和药物开发具有重要的指导意义。而目前传统的线粒体功能研究方法是将细胞破碎后抽提线粒体组分，然后进行相应的生理、生化指标检测，存在杂质污染、线粒体活性下降等诸多缺点，不能完全客观反映细胞的能量代谢过程。肾阴虚是中医理论体系中重要的症候之一，机体物质代谢，能量代谢异常是该症候的典型特征，但中医“症”存在主观不确定性使其临床评价指标存在很大争议，而如今尚缺少适用于该项研究的技术方法。
技术实现思路
为了至少解决在上述
技术介绍
所描述的现有技术缺陷，本专利技术的技术方案在多个方面提供了一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法及使用该方法检测肾阴虚症实验动物的方法。根据本专利技术的第一方面，提供一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，包括：白细胞的提取S1，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；接种所述白细胞S2，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及线粒体呼吸功能的检测S3，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。根据本专利技术的一个实施例，所述线粒体呼吸功能的检测S3包括：呼吸水平基础值的检测S31，检测所述白细胞的基础氧消耗速率，以得到所述白细胞的呼吸水平基础值；三磷酸腺苷ATP关联呼吸值的检测S32，向所述细胞培养板中加入ATP合成酶阻断剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第一速率值，并将所述呼吸水平基础值与所述第一速率值作差值，以得到所述ATP关联呼吸值；呼吸能力储备值的检测S33，向所述细胞培养板中加入呼吸链解偶联剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到氧消耗最大速率值，并将所述氧消耗最大速率值与所述呼吸水平基础值作差值，以得到所述呼吸能力储备值；以及呼吸最大潜能值的检测S34，向所述细胞培养板中加入呼吸链抑制剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第二速率值，将所述氧消耗最大速率值与所述第二速率值作差值，以得到所述呼吸最大潜能值。根据本专利技术的另一个实施例，所述白细胞的提取S1包括：将采集的所述血液样本与抗凝剂混合均匀并静置，常温下对其进行离心分离，以得到中间层细胞S11；吸取所述中间层细胞并向其中加入磷酸平衡盐PBS缓冲液，离心后除去上层的所述PBS缓冲液，得到白细胞混合液S12；除去残留红细胞步骤S13，向所述白细胞混合液中加入红细胞裂解液，吹打均匀并于冰上2～8℃裂解，离心分离以除去红细胞杂质；以及洗涤步骤S14，用所述PBS缓冲液一次或多次的洗涤除杂后的所述白细胞混合液，以得到所述白细胞。根据本专利技术的又一个实施例，所述除去残留红细胞步骤S13中的裂解温度为4℃，裂解时间为3分钟；所述方法进一步包括：在所述洗涤步骤S14之前重复所述除去残留红细胞步骤S13一次或多次，直至所述白细胞混合液中的所述红细胞杂质完全裂解。根据本专利技术的一个实施例，所述用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理包括：将细胞黏附剂加入到碳酸钠缓冲液中，并吹打均匀；将稀释后的细胞黏附剂加入到所述细胞培养板的每个检测孔内并静置；以及吸弃所述每个检测孔内的所述碳酸钠缓冲液，用无菌水洗涤所述细胞培养板，吹干后于4℃保存备用。根据本专利技术的另一个实施例，所述白细胞培养基包括丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖，且所述白细胞培养基的pH值为7.4，所述丙酮酸钠、谷氨酰胺和葡萄糖的浓度比为1：2：10。根据本专利技术的又一个实施例，所述配制白细胞培养基包括：将1mL的100mM丙酮酸钠、1mL的200mM谷氨酰胺及400μL的2.5M葡萄糖加入至97.6mL的基础培养基中，混匀后加入氢氧化钠溶液以调节pH值为7.4，过滤除菌后于4℃保存。根据本专利技术的一个实施例，在进行所述线粒体呼吸功能的检测S3之前进一步包括：对检测探针板进行水化处理；以及向所述检测探针板的加药仓中加入一种或多种影响所述白细胞状态的药剂，以便于在所述线粒体呼吸功能的检测S3过程中向所述细胞培养板中接种的所述白细胞加入所述药剂。根据本专利技术的第二方面，提供一种使用如本专利技术的第一方面中任一项所述的方法检测肾阴虚症实验动物的方法，包括：设置对照组和模型组S10，将实验动物分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物具有所述肾阴虚症；检测所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能S20，分别采集所述对照组和所述模型组的实验动物的血液样本，并按照如本专利技术的第一方面中任一项所述的方法进行检测；以及对比所述对照组和所述模型组的白细胞线粒体呼吸功能的检测结果，以评价所述模型组的实验动物的线粒体呼吸功能S30。根据本专利技术的一个实施例，所述设置对照组和模型组S10包括：将实验动物按照体重随机分为所述对照组和所述模型组，其中所述模型组的实验动物灌胃给与450mg/kg体重的甲状腺片混悬液，所述对照组的实验动物灌胃给予0.9％的氯化钠注射液，两组实验动物均每天灌胃一次，连续灌胃14天。通过上述对本专利技术的技术方案及其多个实施例的描述，本领域技术人员可以理解本专利技术的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法通过提取完整白细胞，并对其进行线粒体呼吸功能的检测，可以用于研究完整细胞状态下的线粒体功能，能够对细胞能量代谢过程进行实时监测，并可以有效避免检测过程中线粒体的活性下降以及杂质污染等因素的影响。进一步地，本专利技术还提供了一种使用上述方法检测肾阴虚症实验动物的方法，以便于研究肾阴虚症的实验动物的线粒体呼吸功能，从而为肾阴虚症的研究提供了一种全新的方法。附图说明通过结合附图，可以更好地理解本专利技术的上述特征，并且其众多目的，特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的，其中相同的附图标记表示相同的部件，并且其中：图1是总体上示出根据本专利技术的检测白细胞线粒体呼吸功能的方法的流程示意图；图2是示出根据本专利技术的线粒体呼吸功能的检测S3的一个实施例流程示意图；图3是示出根据本专利技术实施例的如图2所示的方法检测白细胞氧消耗速率的曲线示意图；图4是根据本专利技术实施例的白细胞的提取S1的流程示意图；图5是总体上示出根据本专利技术的检测肾阴虚症实验动物的白细胞线粒体呼吸功能的方法流程示意图；图6是示出根据本专利技术实施例的对照组和模型组实验大鼠的体征示意图；图7是示出根据本专利技术实施例的对照组和模型组实验大鼠的直肠温测量结果示意图；图8是示出根据本专利技术实施例的对照组和模型组实验大鼠的给药时间与体重变化的曲线示意图；...

【技术保护点】
1.一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，包括：/n白细胞的提取(S1)，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；/n接种所述白细胞(S2)，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及/n线粒体呼吸功能的检测(S3)，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测白细胞线粒体呼吸功能的方法，包括：
白细胞的提取(S1)，采集血液样本并对所述血液样本进行分离，并提取其中的所述白细胞；
接种所述白细胞(S2)，用细胞黏附剂对细胞培养板进行处理，并配制白细胞培养基，用所述白细胞培养基稀释所述白细胞并将其接种到所述细胞培养板上；以及
线粒体呼吸功能的检测(S3)，通过检测所述细胞培养板中接种的所述白细胞的不同状态的氧消耗速率，以实时监测所述白细胞中的所述线粒体呼吸功能。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体呼吸功能的检测(S3)包括：
呼吸水平基础值的检测(S31)，检测所述白细胞的基础氧消耗速率，以得到所述白细胞的呼吸水平基础值；
三磷酸腺苷ATP关联呼吸值的检测(S32)，向所述细胞培养板中加入ATP合成酶阻断剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第一速率值，并将所述呼吸水平基础值与所述第一速率值作差值，以得到所述ATP关联呼吸值；
呼吸能力储备值的检测(S33)，向所述细胞培养板中加入呼吸链解偶联剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到氧消耗最大速率值，并将所述氧消耗最大速率值与所述呼吸水平基础值作差值，以得到所述呼吸能力储备值；以及
呼吸最大潜能值的检测(S34)，向所述细胞培养板中加入呼吸链抑制剂，并检测所述白细胞的氧消耗速率，得到的稳定速率值作为第二速率值，将所述氧消耗最大速率值与所述第二速率值作差值，以得到所述呼吸最大潜能值。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述白细胞的提取(S1)包括：
将采集的所述血液样本与抗凝剂混合均匀并静置，常温下对其进行离心分离，以得到中间层细胞(S11)；
吸取所述中间层细胞并向其中加入磷酸平衡盐PBS缓冲液，离心后除去上层的所述PBS缓冲液，得到白细胞混合液(S12)；
除去残留红细胞步骤(S13)，向所述白细胞混合液中加入红细胞裂解液，吹打均匀并于冰上2～8℃裂解，离心分离以除去红细胞杂质；以及
洗涤步骤(S14)，用所述PBS缓冲液一次或多次的洗涤除杂后的所述白细胞混合液，以得到所述白细胞。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述除去残留红细胞步骤(S13)中的裂解温度为4℃，裂解时间为3分钟；
所述方法进一步包括：在所述洗涤步骤(S14)之前重复所述除...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，陈浩宇，张飞翔，
申请(专利权)人：北京博瑞世安科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11