一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法技术

本发明专利技术公开了一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，属于家禽选育技术领域，该方法比较不同RFI绍兴鸭之间的差异代谢物，找到在蛋鸭的饲料利用率中起决定作用的代谢通路从而加快绍兴鸭的选育进程。本发明专利技术从本研究结果来看，差异代谢物大多为糖类、脂类、氨基酸类以及少量酸和酮等，而大量学者研究表明，糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢有着极为紧密的联系。HRFI组直肠内容物代谢物含量显著高于LRFI组，而在肠道菌群研究中我们得知LRFI群体的肠道有益菌群多样性以及丰度显著高于HRFI群体，且LRFI组差异代谢物显著低于HRFI组。

【技术实现步骤摘要】
一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法
本专利技术属于家禽选育
，具体地说，涉及一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法。
技术介绍
代谢物是机体与环境之间的物质和能量交换以及生物体内物质和能量的自我更新过程产生的物质，根据机体发育是否必须分为初级代谢物和次级代谢物，初级代谢物成分和含量的变化会导致机体发生突变甚至死亡，因此对代谢物的研究是必要的，最早运用代谢物检测的概念可以追溯到中国古代，人们用蚂蚁定性鉴定尿液中的葡萄糖水平。代谢组学的出现克服了只能检测单一代谢物的缺点，能够检测机体新陈代谢过程中产生的所有能够被检测到的代谢物，从代谢物检测到代谢组学检测的进步得益于相关科学技术的进步，20世纪60-70年代，气相色谱(GC)、液相色谱(LC)和质谱(MC)的专利技术使得代谢物的定量检测成为可能，Horning及其同事运用气相-质谱联用技术测量出了人类尿液和组织中的提取物，随着高灵敏度的质谱(MC)和核磁共振技(NMR)的发现以及计算机科学催生的多元分析统计的发展，代谢组学技术终于在20世纪末诞生了。代谢组学研究对象是相对分子质量小于1000的小分子物质，研究对象的相对分子质量远远小于蛋白组学和转录组学的研究对象，检测更容易，基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学共同构成组学(Omics)，基因组学、转录组学和蛋白组学都预示了机体可能将会发生的现象，代谢组学则说明了机体已经发生的现象，能够更系统、更精确地反应机体生命活动的状态，能够观测动植物体内代谢物变化与特定基因表达变化之间的联系，研究代谢产物在动植物生长发育与环境之间应答中的作用，从而进一步揭示生物体在特定时间、特定环境下代谢网络的整体状态，深入解析生命活动规律的内在机制，因此代谢组学被广泛运用于药物开发，营养学和环境科学等多种领域。剩余采食量(RFI)是遗传育种的重要性状，低RFI往往意味着更好的产肉和产蛋性能，以RFI作为表观选择标准的同时，人们也想更深入了解高低剩余采食量家畜分子水平的区别，以期深度了解其中的机制从而进一步改进家畜育种的进程。目前将RFI与代谢组学的联合研究已有先例，FranciscoJoséNovais等人用血清样本进行代谢组学分析寻找早期代谢组学特征，在实验中发现视黄醇代谢途径的视黄醛、孕酮、硬脂酸、沃米洛尔、2,3二氢黄酮、柠檬酸和植酸在高剩余采食量的肉牛中都高水平表达，证明维生素A在饲料效率中的重要性。BarbaraU等人研究限饲条件下不同饲料效率鸡的血清代谢组学特征，结果显示家禽中10中氨基酸和RFI的分级相关，其中异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、组氨酸和鸟氨酸是主要的高RFI的鉴别因子，肌肽、腐胺、和三酰甘油磷脂的含量与采食量和体重增加呈正相关，牛磺酸解释了与RFI相关的变异，此外与胰岛素相关的磷脂酶A2和花生四烯酸代谢有有一定的变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出了一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，该方法比较不同RFI绍兴鸭之间的差异代谢物，找到在蛋鸭的饲料利用率中起决定作用的代谢通路从而加快绍兴鸭的选育进程。其技术方案如下：一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，包括以下步骤：步骤1、粪便样品处理1).称取60mg样本，加入内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均为甲醇配制)各20μL和600μL的甲醇：水(V:V＝4:1)；2).加入两个小钢珠，在-20℃放置2min预冷，加入研磨机(60Hz，2min)；3).超声提取10min；4).-20℃静置30min；5).离心10min(13000rpm，4℃)，取300μL上清液挥干，然后用400μL甲醇：水(V:V＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min。6).离心10min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取150μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃下保存，直到进行LC-MS分析。7).质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同。步骤2、LC-MS处理分析数据采集：色谱柱ACQUITYUPLCBEHC18(100mm×2.1mm,1.7um)；色谱柱温为起始温度45℃，保留2min，以10℃/min的速度升至180℃，然后以5℃/min升至240℃，再以25℃/min升至290℃，保留9min；流速0.35mL/min，载气为超纯氦气(≥99.999％)；不分流进样1.0μL；接口温度220℃；离子源温度220℃；溶剂延时6min；电离方式EI；电子能量70eV；全扫描方式，质谱扫描范围(m/z)为30～550，以每秒10张谱的方式采集。步骤3、数据处理和分析质谱仪和色谱仪的到的原始数据经过预处理之后。使用ChromaTOF软件v4.22(Leco)进行多重分析。对用软件预处理之后的数据集，采用模式识别的方法进行主成分分析法(PCA)来分析其动态变化，将数据信息转化为空间信息，可以初步分析各组样本间的总体分布状况，自然聚集状态是否存在差异较大的样本。或者将数据集导入到SIMCA-P13.0软件包中(Umetrics,Umea,Sweden)进行多维统计分析，VIP(variableimportance)值代表代谢物差异情况，当VIP＞1.0时说明代谢物差异变化较大，并结合t检验(P＜0.05)进一步对VIP＞1.0进行筛选，最终筛选出具有显著差异的代谢物。将筛选出来的这些差异代谢物的数据集，导入到MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca)网站中，对这些差异代谢物所涉及的代谢通路进行进一步的分析，更深一步挖掘这些差异代谢物所蕴含的生物信息。进一步，步骤1中，所有提取试剂使用前均在-20℃进行预冷。本专利技术的有益效果为：本专利技术从本研究结果来看，差异代谢物大多为糖类、脂类、氨基酸类以及少量酸和酮等，而大量学者研究表明，糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢有着极为紧密的联系。HRFI组直肠内容物代谢物含量显著高于LRFI组，而在肠道菌群研究中我们得知LRFI群体的肠道有益菌群多样性以及丰度显著高于HRFI群体，且LRFI组差异代谢物显著低于HRFI组，初步预测，HRFI组绍兴鸭可能对饲粮的利用效率较低，大量的营养物质在降解后经肠道吸收效率较低，随粪便排出体外造成浪费，从而在表型上表现为采食量较高，但在体增重上无明显变化，而在产蛋重上低于LRFI组。附图说明图1为不同RFI绍兴鸭直肠内容物PCA得分图；图2为不同RFI绍兴鸭直肠内容物PLS-DA得分图；图3为不同RFI绍兴鸭直肠内容物OPLS-DA得分图；图4为HRFI/LRF火山图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物饲养管理试验用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，其特征在于，/n步骤1、粪便样品处理/n1).称取60mg样本，加入内标：L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；Lyso PC17:0，0.01mg/mL，各20μL和600μL的甲醇：水V:V＝4:1；/n2).加入两个小钢珠，在-20℃放置2min预冷，加入研磨机，60Hz，2min；/n3).超声提取10min；/n4).-20℃静置30min；/n5).13000rpm，4℃条件下，离心10min，取300μL上清液挥干，然后用400μL甲醇：水(V:V＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min；/n6).13000rpm，4℃条件下，离心10min，用注射器吸取150μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃下保存，直到进行LC-MS分析；/n7).质控样本由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同；/n步骤2、LC-MS处理分析/n数据采集：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18；色谱柱温为起始温度45℃，保留2min，以10℃/min的速度升至180℃，然后以5℃/min升至240℃，再以25℃/min升至290℃，保留9min；流速0.35mL/min，载气为超纯氦气；不分流进样1.0μL；接口温度220℃；离子源温度220℃；溶剂延时6min；电离方式EI；电子能量70eV；全扫描方式，质谱扫描范围m/z为30～550，以每秒10张谱的方式采集；/n步骤3、数据处理和分析/n质谱仪和色谱仪的到的原始数据经过预处理之后；使用Chroma TOF软件v4.22进行多重分析；对用软件预处理之后的数据集，采用模式识别的方法进行主成分分析法来分析其动态变化，将数据信息转化为空间信息，初步分析各组样本间的总体分布状况，自然聚集状态是否存在差异较大的样本；或者将数据集导入到SIMCA-P13.0软件包中进行多维统计分析，VIP值代表代谢物差异情况，当VIP＞1.0时说明代谢物差异变化较大，并结合t检验，P＜0.05，进一步对VIP＞1.0进行筛选，最终筛选出具有显著差异的代谢物；将筛选出来的这些差异代谢物的数据集，导入到MetaboAnalyst网站中，对这些差异代谢物所涉及的代谢通路进行进一步的分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种不同剩余采食量对蛋鸭肠道代谢组的研究方法，其特征在于，
步骤1、粪便样品处理
1).称取60mg样本，加入内标：L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，各20μL和600μL的甲醇：水V:V＝4:1；
2).加入两个小钢珠，在-20℃放置2min预冷，加入研磨机，60Hz，2min；
3).超声提取10min；
4).-20℃静置30min；
5).13000rpm，4℃条件下，离心10min，取300μL上清液挥干，然后用400μL甲醇：水(V:V＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min；
6).13000rpm，4℃条件下，离心10min，用注射器吸取150μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃下保存，直到进行LC-MS分析；
7).质控样本由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同；
步骤2、LC-MS处理分析
数据采集：色谱柱ACQUITYUPLCBEHC18；色谱柱温为起始温度45℃，保留2min，以10℃/min的速度升至180℃，然后以5℃/min升至240℃，再以25℃/min升至290℃，保留9min；流速0.35mL/min，载气为超纯氦气；不分流进样1.0μL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢立志，杨华，李国勤，白天，赵阿勇，曾涛，屠炳江，沐建煜，李浙烽，田勇，沈军达，陈黎，陶争荣，徐坚，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33