一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用。所述紫菜多糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。本发明专利技术的紫菜多糖酶能够以内切方式降解紫菜多糖，该酶对于经典的紫菜多糖结构片段以及甲基化的紫菜多糖结构片段均具有高效的催化能力；通过控制加酶量或反应时间等条件，可快速降解紫菜多糖生成分子量为1kDa‑171kDa的不同分子量紫菜多糖及寡糖。

【技术实现步骤摘要】
一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用。
技术介绍
紫菜具有可食用性且营养价值高，是我国大规模养殖的重要经济红藻之一。紫菜多糖存在于紫菜细胞壁及细胞间隙中，是紫菜的主要多糖组分，含量约占紫菜干重的40％。紫菜多糖具有丰富的生理调节功能，其巨大的应用潜力被广泛认可。紫菜多糖结构主要由(1-4)-O-α-l-吡喃半乳糖-6-硫酸基残基(L6S)及(1-3)-O-β-d-吡喃半乳糖残基(G)交替连接组成。与自然界中其他多糖相似，紫菜多糖的结构也被证实具有高度异质性，其结构中含有琼脂糖单元的取代；此外，紫菜多糖结构中的G残基往往被甲基化修饰，且修饰程度高达50％。紫菜多糖的分子量大，生物利用度低；其粘度高，在分离纯化过程中难分离、产品后处理繁琐，导致其产品纯度及得率低。由紫菜多糖降解得到的低分子量紫菜多糖及寡糖具有粘度低、水溶性好、生物利用率高等特点，是潜在的功能食品因子，在食品、医药行业中展现出良好的应用前景。酶法降解获取低分子量紫菜多糖及寡糖符合目前绿色清洁生产的发展趋势。紫菜多糖酶是一类可特异性降解紫菜多糖的水解酶，其断裂糖链中的β-1,4糖苷键，生成低分子量紫菜多糖及寡糖。糖苷水解酶的高度特异性以及多糖结构的异质性，意味着多糖的完全转化需要特异性不同的水解酶。对于甲基化程度可高达50％的紫菜多糖而言，能够容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶对于紫菜多糖的完全转化至关重要。而在目前的研究报道中，仅有一种野生型紫菜多糖酶(来源菌株：PseudoalteromonasatlanticaT6c)被证实能够在切割位点处容受甲基化半乳糖，即能够降解甲基化糖链结构。野生酶需要在紫菜多糖底物的诱导下才可产生紫菜多糖酶，酶的制备成本高、纯化难度大，且产酶总量低、活力低，难以用于低分子量紫菜多糖及寡糖的大规模生产应用中。分子克隆可以依据基因实现酶的高效表达及大量获取，是解决以上问题的理想策略。实现产酶序列的克隆表达可为酶法降解紫菜多糖提供工具，为低分子量紫菜多糖及寡糖的大规模生产应用提供前提。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是野生型容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶产量低、活力低、纯化难度大，产酶菌株需在紫菜多糖底物的诱导下才可产酶，致使酶的制备成本高，而且紫菜多糖的完全转化也缺少关键的工具酶。为解决上述问题，本专利技术从WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T菌株中发掘得到一条基因，其原始核苷酸编码290个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。利用SignalP软件预测1-21位氨基酸为信号肽序列，利用ExPASy软件预测其理论分子量为35.5kDa。根据序列比对发现此酶与目前已知紫菜多糖酶的相似性最高仅为31％，所以此酶为一种序列新颖的酶。以此为基础提供一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的基因及其应用，从而突破该类酶的高效获取及实际应用、紫菜多糖的完全转化、低分子量紫菜多糖及寡糖规模化制备的关键瓶颈。为达到上述目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。SEQIDNO.1：MKTKYFYFLIFLVLLSNTMFAQELTIPPKKYVDSVKIESAVNRINNSYPLSDQQNSKKWKLLKEVSDEFNGDKLNTILWFPNNPKWKGRPPTFFHDSNVKIENDELVIRVNQHGKDSLPKYFTHSTGFIKSKNKFLYGYFEAECKLMDAPWVSGFWMTNAGKDWWTEIDICENAPGVSYNRHDLNSNIHVFKSPKEQGNIKKHFSRTKKYYFPKELQADYHVWGLEWTAKYIRFYIDGVLFREAENTHWHQPLEVNFNCESNKWFGALPDNNRLDGEFHVKYFRAWKLTK该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为31％(与来源于ZobelliagalactanivoransDsijT的PorB相似度最高)，为一种序列新颖的酶。利用MEGA6将该酶与CAZy数据库中的GH16家族已性质研究的序列构建系统发育树，结果如图6所示：可以看出该酶处于GH16家族的系统发育树中，与经典的紫菜多糖酶的进化分支相邻，并且形成了单独的进化分支。因此，本专利技术中的紫菜多糖酶是GH16家族的一个新成员。一种编码上述容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.2及可翻译出SEQIDNO.1的所有基因。SEQIDNO.2：ATGAAAACAAAATATTTTTATTTTCTCATATTTTTAGTGCTTTTATCTAATACAATGTTTGCACAAGAGTTAACAATTCCTCCCAAAAAATATGTGGATTCTGTTAAAATTGAATCTGCAGTAAATAGAATAAACAATAGTTATCCATTGTCAGATCAGCAAAACTCAAAAAAGTGGAAATTGTTAAAAGAGGTGTCAGATGAGTTTAATGGGGATAAATTAAATACAATTCTATGGTTTCCCAATAATCCTAAATGGAAAGGAAGGCCACCTACTTTTTTTCATGACTCTAATGTAAAGATAGAAAATGATGAATTAGTTATTCGGGTAAATCAACATGGTAAAGATTCTTTGCCAAAATATTTTACACATTCTACAGGGTTTATAAAAAGTAAAAATAAATTCTTATACGGTTATTTTGAAGCTGAATGTAAATTAATGGATGCTCCTTGGGTGTCTGGTTTTTGGATGACCAATGCAGGTAAAGATTGGTGGACAGAAATAGACATATGCGAAAATGCACCAGGAGTATCATACAATCGTCATGATCTAAATTCAAATATCCATGTTTTTAAATCTCCTAAAGAACAAGGAAACATAAAAAAACATTTTTCACGAACTAAAAAATATTATTTTCCAAAGGAGTTACAAGCAGATTATCATGTTTGGGGATTGGAATGGACAGCCAAATACATTCGTTTTTATATTGATGGCGTTTTATTTCGTGAGGCAGAAAATACCCATTGGCATCAGCCTTTAGAAGTTAATTTTAATTGTGAATCAAACAAATGGTTTGGTGCTTTACCAGATAACAATCGATTAGATGGTGAATTTCACGTAAAGTATTTTAGAGCTTGGAAACTAACAAAATAA本专利技术提供了一种上述容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的制备方法，将酶异源表达在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等体系中，通过诱导产酶即可大量制备紫菜多糖酶。上述的容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶成功异源表达在了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶，其氨基酸序列为SEQIDNO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。


2.编码权利要求1中紫菜多糖酶对应的基因，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示及可翻译出SEQIDNO.1的所有序列。


3.包含SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。


4.一种表达紫菜多糖酶的重组质粒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：常耀光，张玉莹，薛长湖，申晶晶，陈广宁，唐庆娟，张恬恬，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37