一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物学领域，具体公开了一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，包括以下步骤：S1：将聚已内酯、明胶和氧化石墨烯均匀溶解于极性溶剂中，得到混合溶液，混合溶液中聚已内酯、明胶和氧化石墨烯的质量百分比浓度分别为69.6％、29.8％和0.6％；S2：将S1得到的混合溶液置于连接有高压发生器的微量注射泵中进行静电纺丝，即得到生物膜。通过本发明专利技术可制备出既支持ESC‑RPE细胞生长和功能，又可兼顾生物相容性和手术操作性的纳米纤维复合膜。

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法
本专利技术涉及生物学领域，尤其涉及一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法。
技术介绍
视网膜色素上皮(RPE)是位于视网膜与脉络膜之间的单层细胞，具有分泌营养因子，吞噬感光细胞外节，参与视循环代谢等功能，对于维持视网膜的正常生理功能具有十分重要的作用。RPE功能障碍将导致感光细胞凋亡，引起如年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)等视网膜变性疾病。这类疾病在我国发病趋势逐年上升，但尚缺乏有效治疗措施。组织工程化RPE移植是将RPE细胞培养在生物膜上，形成有极性、有功能的单层RPE细胞片后，再将RPE细胞片和生物膜复合体移植到视网膜下腔，是治疗视网膜变性疾病最有前景的方法。组织工程化RPE所需要的两大要素是种子细胞和生物膜。在种子细胞方面，胚胎干细胞(ESC)分化而来的RPE细胞(ESC-RPE)具有与体内RPE细胞相似的形态和功能，无基因变异风险，分化效率高，可实现标准化、产业化生产，是理想的种子细胞。然而，通过现有工艺制备的生物膜，在支持RPE细胞生长和功能的前提下，并无法兼顾生物相容性和手术操作性，从而限制了组织工程RPE移植的进一步应用。为解决上述问题，就需要一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，可制备出既支持ESC-RPE细胞生长和功能，又可兼顾生物相容性和手术操作性的纳米纤维复合膜。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，可制备出既支持ESC-RPE细胞生长和功能，又可兼顾生物相容性和手术操作性的纳米纤维复合膜。为达到上述目的，本专利技术提供了一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，包括以下步骤：S1：将聚已内酯、明胶和氧化石墨烯均匀溶解于极性溶剂中，得到混合溶液，混合溶液中聚已内酯、明胶和氧化石墨烯的质量百分比浓度分别为69.6％、29.8％和0.6％；S2：将S1得到的混合溶液置于连接有高压发生器的微量注射泵中进行静电纺丝，即得到生物膜。作为对上述技术方案的进一步改进，在步骤S1中，所述极性溶剂为六氟异丙醇。作为对上述技术方案的进一步改进，在步骤S1中，所述氧化石墨烯为粉末状并通过以下步骤制备：S11：取10g32目高纯石墨，0℃下加入到500mL浓硫酸中；S12：再加入60gKMnO4，升温到35℃，搅拌；S13：加水稀释后，加入H2O2至溶液呈黄色，加入HCl离心洗涤，透析至PH＝6.0；S14：离心10min后取上层清液，冷冻干燥后即得到氧化石墨烯粉末。作为对上述技术方案的进一步改进，在步骤S2中，静电纺丝参数为：总浓度8％-10％，电压10-15kV，喷头到接收器距离10-20cm，电纺流速1-3mL/h。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益技术效果：本专利技术提供的一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，通过静电纺丝技术，以聚己内酯、明胶和氧化石墨烯为原料，制备出的生物膜支持ESC-RPE细胞的生长和功能，可用于构建组织工程化RPE移植片，并且该移植片可成功地移植到实验动物的视网膜下腔，并具有良好的生物相容性，有望为视网膜变性疾病的治疗提供新的策略。附图说明图1为本专利技术实施例一制备的生物膜的扫描电镜照片；图2为本专利技术实施例一制备的生物膜的纳米纤维直径统计图；图3为本专利技术实施例二中RPE65和ZO-1的表达情况检测结果图；图4为本专利技术实施例二中ESC-RPE细胞的透射电镜图；图5为本专利技术实施例二中组织工程化RPE与对照组差异基因聚类热图；图6为本专利技术实施例二中组织工程化RPE与对照组基因表达的相关性热图；图7为本专利技术实施例二中移植后兔眼的视网膜结构图；图8为本专利技术实施例二中移植后兔眼与正常兔眼在视网膜功能上的比较图；图9为本专利技术实施例二中兔眼移植区部分视网膜切片甲苯胺蓝染色图。具体实施方式为使本领域技术人员更好地理解本专利技术的技术方案及其有益效果，下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例一本实施例提供一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，包括下述的步骤S1和S2：S1：将聚已内酯(PCL)、明胶(Gelatin)和氧化石墨烯(GO)均匀溶解于极性溶剂中，得到混合溶液，混合溶液中聚已内酯、明胶和氧化石墨烯的质量百分比浓度分别为69.6％、29.8％和0.6％。其中，所述极性溶剂优选为六氟异丙醇(HFIP)。所述氧化石墨烯为粉末状并可通过以下步骤制备：S11：取10g32目高纯石墨(采购自青岛天元石墨有限公司)，0℃下加入到500mL浓硫酸中；S12：再加入60gKMnO4，升温到35℃，搅拌2小时；S13：加水稀释后，加入H2O2至溶液呈黄色，加入HCl离心洗涤，透析至PH＝6.0；S14：离心(3500rpm)10min后取上层清液，冷冻干燥72h后即得到氧化石墨烯粉末。S2：将S1得到的混合溶液置于连接有高压发生器的微量注射泵中进行静电纺丝，即得到生物膜。其中，静电纺丝参数可为：总浓度8％-10％，电压10-15kV，喷头到接收器距离10-20cm，电纺流速1-3mL/h。优选地，这些参数为：总浓度9％，电压12.5kV，喷头到接收器距离15cm，电纺流速2mL/h。采用扫描电镜观察电纺纤维的形貌，imageJ软件统计纤维的平均直径和直径分布。如图1和图2所示，本实施例制备的聚己内酯/明胶/氧化石墨烯纳米纤维复合膜(PCL/Gelatin/GO膜，即制备的生物膜)呈多孔纤维状，纳米纤维直径不等，主要集中于200～400nm。实施例二本实施例对实施例一所制备的生物膜的功能及特性进行检验。(一)ESC-RPE细胞的诱导分化将人胚胎干细胞H1(来自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，货号为SCSP-301)不传代连续培养35～45天后，出现直径约1mm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为RPE细胞，待生长至融合时，经0.25％(质量百分比浓度)胰蛋白酶37℃消化10min，计数，以1×105/cm2的密度将RPE细胞均匀接种于已包被过基质胶(来自美国BD公司)的细胞培养板中，小心移至细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养，2～3天半量换液。ESC-RPE细胞培养所需的培养基为：高糖DMEM基础培养基，20％(质量百分比浓度)KSR(KnockOutTMSerumReplacement)，1％(质量百分比浓度)非必需氨基酸，1mML-谷氨酰胺，均购自美国Invitrogen公司。(二)构建组织工程化RPE移植片将实施例一制备的生物膜裁剪为直径10mm的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：将聚已内酯、明胶和氧化石墨烯均匀溶解于极性溶剂中，得到混合溶液，混合溶液中聚已内酯、明胶和氧化石墨烯的质量百分比浓度分别为69.6％、29.8％和0.6％；/nS2：将S1得到的混合溶液置于连接有高压发生器的微量注射泵中进行静电纺丝，即得到生物膜。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将聚已内酯、明胶和氧化石墨烯均匀溶解于极性溶剂中，得到混合溶液，混合溶液中聚已内酯、明胶和氧化石墨烯的质量百分比浓度分别为69.6％、29.8％和0.6％；
S2：将S1得到的混合溶液置于连接有高压发生器的微量注射泵中进行静电纺丝，即得到生物膜。


2.根据权利要求1所述的一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述极性溶剂为六氟异丙醇。


3.根据权利要求1所述的一种用于构建组织工程化视网膜色素上皮的生物膜的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴畏，付琰，刘增平，黎其友，刘勇，阴正勤，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50