杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法技术

本发明专利技术涉及中药分析评价领域，具体涉及一种杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。本发明专利技术利用HPLC‑UV‑DPPH法同时筛选、定量杨梅叶中黄酮类抗氧化提取物以及评价其抗氧化能力。脱脂后的杨梅叶经盐酸‑无水乙醇提取粗提液进行反相HPLC梯度洗脱法分离并定量，对流出液中具有抗氧化活性的成分与DPPH·反应被分离检测；根据检测得到的与DPPH·反应后的成分是否出现负峰，筛选具有抗氧化活性的成分。本发明专利技术无须繁琐的分离纯化过程，可快速对杨梅叶提取物的抗氧化成分进行定量和活性评价，提取物成分更具体，成分活性更明确；方法更快速防样品氧化降解，为快速评价杨梅叶这类可能含有易氧化降解的中药提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】
杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法
本专利技术涉及中药分析评价领域，具体涉及一种杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。
技术介绍
杨梅是杨梅科杨梅属的常绿小乔木，拥有可观的经济价值。杨梅叶中富含黄酮、有机酸、多糖等多种生物活性成分，具有降血糖、肝脏保护、抗氧化、抗菌等作用。研究表明，杨梅叶中主要抗氧化活性成分为黄酮类成分，主要有杨梅苷、杨梅素、槲皮素、山奈酚等，是天然抗氧化剂的良好来源。但杨梅叶的抗氧化提取物不稳定，现有的文献对抗氧化提取物的成分不明确，各组分的抗氧化贡献不清楚，现代药学趋势需要对提取物进行快速在线评价和定量检测。因此，从杨梅叶提取物中快速、在线、高通量筛选抗氧化活性成分，特别是含量较低的活性成分具有重要的意义。目前杨梅叶中黄酮类成分的抗氧化活性成分的筛选研究尚停留在总提取物、总黄酮或杨梅苷、槲皮素等个别化合物层面上，未见以在线筛选的方法一次性分离及评价杨梅叶中的多个抗氧化活性成分的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简单、快速、有效的杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种中药材杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法，所述的方法包括以下步骤：（1）将杨梅叶烘干、粉碎、过筛后脱脂得脱脂杨梅叶细粉，脱脂杨梅叶细粉中加入盐酸乙醇溶液，超声提取数次后合并提取液抽滤浓缩，得到杨梅叶粗提液；（2）对步骤（1）中得到的杨梅叶粗提液放入检测波长为254nm的高效液相色谱仪中进行测定，得到高效液相色谱图，计算峰面积；（3）经由高压输液泵使DPPH·甲醇溶液与步骤（2）中反相HPLC测定后的流出液与混合，经过反应线圈后进入检测波长为517nm的紫外检测器内进行第二维测试，计算出现的峰面积；（4）对比步骤（2）和步骤（3）中的色谱峰面积的变化，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分。判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分的标准为：杨梅叶粗提液中如有抗氧化活性物质，则与DPPH·甲醇溶液反应后，步骤（3）中紫外检测器处的响应值降低，相应的色谱峰为负值，无抗氧化活性的物质无负峰出现。进一步地，本专利技术步骤（1）所述脱脂杨梅叶细粉与盐酸乙醇溶液的用量比为1g：10~20mL，所述的盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为1.0~1.4mol·L-1。步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温25~40℃，流速0.4~1.0mL·min-1。步骤（2）中梯度洗脱方式为：0~30min，20%流动相A，80%流动相B；30~32min，20%~30%A，80~70%流动相B；32~45min，30%A，70%流动相B；均为体积百分比。步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，柱长150~300mm，填料粒径3~5μm。步骤（3）中所述的DPPH·甲醇溶液的浓度为0.2~2mg·L-1。步骤（3）中所述的反应线圈的原材料为聚醚醚酮的管状材料，内径为0.25mm，管长为500~1000cm，反应线圈内流速为0.2~0.4mL·min-1。进一步优选的，在某一具体实施例中还提供了一种同时定量检测杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分含量的方法，具体包括：将杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分对应的标准品配置成系列浓度的溶液，在与步骤（2）中相同的色谱条件下，分别测定不同浓度的标准品对应的色谱图，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线计算待测杨梅叶粗提液中各抗氧化成分的含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术构建一种更为高效的杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分在线评价及定量检测方法，利用HPLC-UV-DPPH法同时筛选、定量杨梅叶中黄酮类抗氧化提取物以及评价其抗氧化能力。脱脂后的杨梅叶经盐酸-无水乙醇提取粗提液进行反相HPLC梯度洗脱法分离并定量，对流出液中具有抗氧化活性的成分与DPPH·反应被分离检测；根据检测得到的与DPPH·反应后的成分是否出现负峰，筛选具有抗氧化活性的成分。本专利技术无须繁琐的分离纯化过程，可快速对杨梅叶提取物的抗氧化成分进行定量和活性评价，提取物成分更具体，成分活性更明确；方法更快速防样品氧化降解，为快速评价杨梅叶这类可能含有易氧化降解的中药提供了新的思路。附图说明图1是HPLC反应后和第二维中的色谱对比图；图中A是第一维反应后的色谱图；图2是杨梅叶中抗氧化成分及VC和Trolox对DPPH自由基的清除能力曲线图。具体实施方式以下将结合说明书附图及具体实施方式，对本专利技术的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本专利技术的技术方案及其优点，并不对本专利技术的保护范围构成限制。实施例1本专利技术中的方法采用高效液相色谱仪（HPLC）进行测定，实施例中的高效液相色谱仪为LC-10ATVP型高效液相色谱仪，该色谱仪配有SPD-10A型二极管阵列检测器、N2000型色谱数据工作站等。采摘的新鲜杨梅叶经反复清洗、烘干后粉碎，过180μm筛，得杨梅叶粉末。称取杨梅叶粉末10g放入圆底烧瓶中，加入10倍体积的石油醚，利用索氏提取器，55℃进行脱脂，待毛细管处石油醚澄清无色时，停止回流，取出杨梅叶细粉在通风橱中自然阴干一晚上，放入烘箱烘干，得脱脂杨梅叶细粉。称取脱脂杨梅叶细粉0.6g，置于锥形瓶中，加入12mL盐酸乙醇溶液（含1.2mol·L-1的盐酸），于功率100W、频率40kHz超声条件下提取2次，每次提取40min。室温冷却，滤过，合并滤液，减压蒸干后用分析级无水乙醇溶解并转移至10mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，得杨梅叶粗提液。分别精密称取10mg槲皮素标准品、杨梅素标准品、杨梅苷标准品、山奈酚标准品置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度，即得质量浓度为1mg/mL的四个黄酮化合物标准品溶液。利用紫外分光光度计在波长200~400nm内对四种黄酮化合物的标准品溶液进行紫外光谱全扫描，结果显示，杨梅苷、杨梅素、槲皮素及山奈酚在波长254nm和360nm处均有良好吸收。由于杨梅素、杨梅苷、槲皮素在360nm处的吸收强度小于254nm处，兼顾三者的灵敏度确定杨梅叶粗提液的检测波长为254nm。基于槲皮素品、杨梅素、杨梅苷、山奈酚的化学结构中均含有酚羟基，具有一定的弱酸性，故在流动相中加入适量磷酸以改善峰形和分离效果。将得到的杨梅叶粗提液注入LC-10ATVP型高效液相色谱仪中进行第一维检测。杨梅叶粗提液在色谱柱上达到分离，得到色谱峰正信号，给出各个组分信息。高效液相色谱仪色谱的条件如下：采用ShimadzuVP-ODSC18柱（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱，柱温30℃；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中药杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将杨梅叶烘干、粉碎、过筛后脱脂得脱脂杨梅叶细粉，脱脂杨梅叶细粉中加入盐酸乙醇溶液，超声提取数次后合并提取液抽滤浓缩，得到杨梅叶粗提液；/n（2）对步骤（1）中得到的杨梅叶粗提液放入检测波长为254 nm的高效液相色谱仪中进行反相HPLC测定，得到高效液相色谱图；/n（3）经由高压输液泵使DPPH·甲醇溶液与步骤（2）中反相HPLC测定后的流出液与混合，经过反应线圈后进入检测波长为517 nm的紫外检测器内进行第二维测试，计算出现的峰面积；/n（4）对比步骤（2）和步骤（3）中的色谱峰面积的变化，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分。/n

【技术特征摘要】
1.一种中药杨梅叶中黄酮类抗氧化活性成分的在线评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将杨梅叶烘干、粉碎、过筛后脱脂得脱脂杨梅叶细粉，脱脂杨梅叶细粉中加入盐酸乙醇溶液，超声提取数次后合并提取液抽滤浓缩，得到杨梅叶粗提液；
（2）对步骤（1）中得到的杨梅叶粗提液放入检测波长为254nm的高效液相色谱仪中进行反相HPLC测定，得到高效液相色谱图；
（3）经由高压输液泵使DPPH·甲醇溶液与步骤（2）中反相HPLC测定后的流出液与混合，经过反应线圈后进入检测波长为517nm的紫外检测器内进行第二维测试，计算出现的峰面积；
（4）对比步骤（2）和步骤（3）中的色谱峰面积的变化，判断杨梅叶中是否含有抗氧化活性成分。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述脱脂杨梅叶细粉与盐酸乙醇溶液的用量比为1g：10~20mL，所述的盐酸乙醇溶液中盐酸的浓度为1.0~1.4mol·L-1。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述高效液相色谱仪的色谱条件包括：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，柱温25~40℃，流速0.4~1.0mL·min-1。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中梯度洗脱方式为：0~30min，20%流动相A，80%流动相B；30~32min，20%~30...

【专利技术属性】
技术研发人员：童珊珊，赵璐，田胜，顾晨露，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32