一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法技术

本发明专利技术涉及一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定转染真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分，培养，收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物与病毒互作靶点基因。本发明专利技术的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物与病毒互作靶点基因。与传统的研究真核生物与病毒互作靶点基因的方法相比，本发明专利技术能够最大限度的筛选真核生物与病毒互作靶点基因，成本低，效率高，范围广。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法
本专利技术属于基因编辑和高通量测序
，涉及一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法。
技术介绍
病毒是一种重要的微生物，个体微小，结构简单，通常只含有一种核酸(DNA或RNA)，并且病毒必须存活在活细胞内。病毒本身核酸非常少，只包含少数必须基因，既没有完整的代谢相关基因，也没有各种复制的酶系统，因此，离开宿主细胞后，病毒虽然还能存活，但是已经没有生命活动了，属于休眠状态。由于病毒自身不具有完成全部生命活动的基因，所以病毒只能借助活细胞的细胞器和胞内环境来完成增殖。病毒是重要的病原微生物，和一系列动物、植物病害密切相关，如感染哺乳动物的流感病毒、免疫缺陷病毒，感染昆虫的杆状病毒，感染植物的烟草花叶病毒、水稻矮缩病毒等。病毒广泛存在，严重威胁着包括人类在内的广大动植物的生命安全。为了防治病毒病，无数科研人员进行了艰苦的探索，解析了大量病毒的基因组、晶体结构，发现了许多病毒侵染真核生物的途径，阐明了很多与病毒侵染密切相关的真核生物信号通路，在一定程度上为真核生物与病毒互作研究奠定了基础。但是，目前还有很多病毒危害动植物，对于很多病毒人类现在都束手无策。基因编辑是研究功能基因组的重要遗传操作技术，目前已经发展了四代，包括大范围核酸内切酶、锌指核酸酶、类转录因子活化因子核酸酶、CRISPR等。目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统是来源于细菌获得性免疫系统的一种基因编辑技术。目前已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等物种中成功实现了基因编辑。因为设计构建简单，成本低廉，编辑效率高，目前CRISPR/Cas9系统的应用范围已经不限于单基因编辑，其应用已经扩展到多基因编辑甚至是全基因组编辑。目前已经在人、小鼠、果蝇、水稻等物种中实现了CRISPR/Cas9系统介导的全基因组编辑。CRISPR/Cas9系统介导的全基因组编辑已经在药物靶点基因筛选、肿瘤发生、免疫反应等研究领域取得了重要成果。综合运用CRISPR/Cas9介导的全基因组编辑手段，对解决真核生物与病毒互作研究具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，具体步骤如下：(1)构建转基因系统递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染作为实验组，另一份作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。作为优选的技术方案之一，所述真核生物为家蚕、果蝇、人等，所述病毒为能够感染真核生物的病毒。作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。作为进一步优选的技术方案之一，按照Cas作用规律，在真核生物全基因组水平设计所有编码蛋白的基因的编辑位点，其打靶位点有如下规律：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，设计的sgRNA序列与其在基因组上的打靶位点序列一致，并有如下规律：5’-G-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；根据以上规律设计真核生物全部编码蛋白的基因的打靶位点。作为进一步优选的技术方案之一，将合成的单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染，直至细胞数量降低至5％，另一份用完全培养基在正常条件下培养相同时间，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或者消耗的基因即为真核生物细胞与病毒互作候选靶点基因。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定转染真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分，其中一份用病毒感染，另一份用不含病毒的培养基培养相同的时间。将两组实验的细胞同时收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物与病毒互作靶点基因。本专利技术的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物与病毒互作靶点基因。与传统的研究家真核生物与病毒互作靶点基因的方法相比，本专利技术能够最大限度的筛选真核生物与病毒互作靶点基因，成本低，效率高，范围广。对筛选真核生物抗病毒靶点基因和研究病毒宿主互作具有极大地意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为本专利技术的工作流程图；图2为已有文献报道的大量家蚕抗BmNPV基因都在我们筛选到的抗BmNPV靶点基因库中，其中，深色散点为已有文献报道的家蚕抗BmNPV基因；图3为KEGGpathway富集分析图。图4为吞噬体途径基因的sgRNA得分图；图5为BmNPV侵染关键通路和抑制通路示意图。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。在众多蚕病中家蚕病毒病对养蚕业的危害最大，尤其是家蚕核型多角体病毒(BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirusNPV)经常给养蚕业带来毁灭性的打击。以下以家蚕及家蚕核型多角体病毒为例说明本专利技术，但本专利技术并不局限于家蚕及家蚕核型多角体病毒。以下凡是未注明的具体实验方法，都按照公认的实验方法与条件实施，例如，按照试剂耗材厂商提供的说明书操作，或者按照经典实验书籍《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)来完成实验。实施例：本实施例中所用到的家蚕胚胎细胞系(TheBombyxmoriembryoniccellline,BmE)为生物实验中常用细胞系(PMID:17570024)。家蚕核型多角体病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus,B本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)构建转基因系统递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；/n(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；/n(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染作为实验组，另一份作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；/n(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建转基因系统递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；
(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；
(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染作为实验组，另一份作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；
(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核生物为家蚕、果蝇、人，所述病毒为能够感染真核生物的病毒。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：马三垣，常珈菘，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50