一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种基于Crisper的新型冠状病毒检测试剂盒，所述crRNA包括：靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3‑4中任一所示；靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5‑6中任一所示。本发明专利技术涉及与新型冠状病毒C端部分序列和N端部分序列相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR‑LwaCas13a系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、不依赖专门的荧光定量PCR仪、检测速度快、灵敏度高(最低检测极限达到10

【技术实现步骤摘要】
一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒。
技术介绍
目前市面上大多采用RT-PCR方法的检测试剂盒，该检测试剂盒所需时间较长、对特殊设备的依赖程度较高、特异性不够且灵敏度不够出现假阴性等情况。因此，急需开发一种快速，特异性强，灵敏度高的病毒学检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种新型冠状病毒的检测试剂盒，特异性强，灵敏度高，最低检测极限达到10-2拷贝/uL以下。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于提供一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，所述crRNA包括：靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.3-4中任一所示；靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.5-6中任一所示。本专利技术的目的之二在于提供一种新型冠状病毒的检测试剂盒，含有所述crRNA。优选地，所述试剂盒还包括LwaCas13a蛋白和荧光探针。优选地，所述分子信标可以采用购买于赛默飞的通用分子信标，所述荧光探针选用的序列的5’端均标记有荧光基团，3’端标记均有猝灭基团。所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和TexasRed中的一种，所述猝灭基团包括TAMRA、DABCYL、MGB、Bio/BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的一种。具体地，所述分子信标可以为5'-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3'，该荧光探针的序列的5’端标记选用FAM基团，3’端标记选用Bio基团。优选地，所述试剂盒还包括RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液、氯化镁溶液。优选地，所述新冠病毒检测试剂盒还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，其中C端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQIDNO.7-8所示；N端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQIDNO.9-10所示。所述扩增体系还包括逆转录酶(单链变双链)，引物、重组酶，DNA聚合酶，ssDNA结合蛋白等，RAP相关试剂需要magnesiumacetate，2mMDTT，5％Carbowax20M，200lMdNTPs，3mMATP，50mMphosphocreatine，100ng/llcreatinekinase等：以上组分可直接采用重组酶聚合酶扩增(RPA)试剂盒Basic；TABAS03KIT。优选地，所述检测试剂盒可以制备成试纸条形式的检测试剂盒或液体形式的试剂盒。本专利技术的目的之三在于提供所述的crRNA、以及所述的试剂盒在用于检测新型冠状病毒上的用途。所述检测试剂盒的使用方法为：S1、核酸提取，采用现有的技术或者产品对样本中的病毒核酸进行提取；S2、病毒RNA逆转录及RPA等温扩增体系扩增得到所需DNA扩增产物；S3、将所述的扩增产物、crRNA、LwaCas13a蛋白、荧光探针、RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液、氯化镁溶液构成的检测体系(如表5和表6所示)进行检测。优选地，将所述检测体系孵育后荧光检测仪测定荧光值。也可以做成便携式检测仪比如胶体金检测试剂盒可以随时随地及时检测，这些应用和方法为后续试剂盒的开发，临床诊断的应用提供了平台，适用于大规模临床样本检测。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和效果：本专利技术提供的用于检测新型冠状病毒的crRNA、试剂盒及检测方法，设计与新型冠状病毒C端部分序列和N端部分序列相关的crRNA，运用此crRNA结合CRISPR-LwaCas13a系统进行突变检测的方法，此方法具有成本低、可多次重复检测、方法简单、检测速度快、灵敏(最低检测极限达到10-2拷贝/uL)、特异，可在短时间内通过荧光信号的变化检测到是否含有目标核酸：在对新型冠状病毒C端部分序列的检测中，反应进行到20-30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本，灵敏度可达到10-2拷贝/uL。在对新型冠状病毒N端部分序列的检测中，反应进行到20-30分钟时，阳性样本的荧光信号明显高于阴性样本，灵敏度可达到10-2拷贝/uL。附图说明图1为特异性检测结果；图2为灵敏性结果。具体实施方式实施例1靶向病毒特异位点crRNA的设计及获得1、基于CRISPR-LwaCas13a系统的新型冠状病毒检测位点的发现本专利技术人根据CDC最新出具的《RT-PCR检测指南》，获得新型冠状病毒特异性区域。针对这些不同区域设计crRNA并构建CRISPR/LwaCas13a系统进行研究。结果表明，以SEQIDNO.1-2所示区域序列为基于CRISPR/LwaCas13a系统的检测位点，具有很好的检测效果。表12、靶向特异性区域crRNA的设计由于CRISPR-Cas13a系统是一种靶向DNA基因编辑系统，其中Cas13a与crRNA结合形成监测复合物，所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与Cas13a蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。本专利技术人发现针对上述两个靶标涉及如下的CrRNA具有很好的检测效果。靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.3-4中任一所示。靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.5-6中任一所示。表2实施例2新型冠状病毒的检测试剂盒及检测方法1、新冠病毒检测试剂盒的组成本试剂盒包括：(1)靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.3-4中任一所示。(2)靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.5-6中任一所示。(3)一条特异性荧光探针(采用购买于赛默飞公司的通用分子信标比如5'-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3')；(4)LwaCas13a蛋白；(5)RNase抑制剂、T7聚合酶、核糖核酸溶液和氯化镁溶液。优选地，为了做出高敏，高特异性检测微量2019-nCov病毒，需要预扩增病毒的核酸，提高丰度，因此优选采用RPA扩增方法，所述新冠病毒检测试剂盒还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，其中C端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQIDNO.7-8所示；N端部分序列的等温扩增引物对序列如SEQIDNO.9-10所示。所述扩增体系还包括逆转录酶(单链变双链)，引物、重组酶，DNA聚合酶，ssDNA结合蛋白等，RAP相关试剂需要magnesiumacetate，2mMDTT，5％Carbowax20M，200lMdNTPs，3mMATP，50mMphosphocreatine，10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括：/n靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.3-4中任一所示；/n靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.5-6中任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括：
靶向C端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.3-4中任一所示；
靶向N端部分序列的crRNA：其序列如SEQIDNO.5-6中任一所示。


2.一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括有权利要求1所述的crRNA。


3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LwaCas13a蛋白和荧光探针。


4.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴兵，耿晨，
申请(专利权)人：宿迁市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32