基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条制造技术

本发明专利技术提供一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，荧光标记的菌喷涂于所述结合垫上，羊抗鼠抗体喷涂于所述硝酸纤维素膜上形成检测线，阳性血清或抗体喷涂于C线形成质控线。另外，本发明专利技术还提供了基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条在快速检测单克隆抗体效价中的应用。本发明专利技术的试纸条检测时灵敏度高、时间短。

【技术实现步骤摘要】
基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条。
技术介绍
单克隆抗体主要是由效应B细胞分泌的，将B细胞与骨髓瘤细胞进行融合，既保持了效应B细胞分泌特异性抗体的能力，同时也具有骨髓瘤细胞的无限增殖的能力。目前单克隆抗体按制备方式有杂交瘤单克隆抗体，重组单克隆抗体和噬菌体展示单克隆抗体等，这些建株制备单克隆抗体的方法各有优缺点，但有一个共同点是制备工艺繁琐，制备周期长，需要多次阳性测试筛选以及建株后的阳性测定。同时，对于获得的单克隆抗体，需要对其进行一个效价的测定，以便有一个更好的稀释指导范围，从而保证了抗体的使用。目前，对单克隆抗体的筛选、效价的测定均依赖间接ELISA方法，该方法主要是将抗原固定在固相载体上，封闭，洗脱，与目标的抗体孵育，洗脱，与酶标二抗孵育，洗脱，形成抗原-抗体-酶标二抗的三元复合物，催化底物形成有色物质，产物的量与抗体的量直接相关，每次测定时间需要5h-24h。这种费时费力的测定方式，已经成为制约单克隆抗体制备及使用的重要瓶颈之一。因此，在检测抗体的阳性及效价时，有必要设计一种利用抗原示踪的高灵敏度的试纸条。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条。本专利技术提供了一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，具有这样的特征：其中，荧光标记的菌喷涂于结合垫上，羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线，阳性血清或抗体喷涂于C线形成质控线。本专利技术还提供了基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条在快速检测单克隆抗体效价中的应用。专利技术的作用与效果根据所涉及的本专利技术的基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条，能够进行便捷、快速的检测抗体的阳性及效价，可大大提高单克隆抗体筛选和制备的效率，能够使高质量的抗体得到快速的应用。附图说明图1是本专利技术实施例中基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价结构图；图2是本专利技术实施例中抗原不同标记方法测试结果图；图3是本专利技术实施例中不同浓度FITC标记革兰氏阴性菌大肠杆菌O157:H7流式细胞仪测试结果图；图4是本专利技术实施例中不同浓度FITC标记革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌流式细胞仪测试结果图；图5是本专利技术实施例中标记后的革兰氏阴性菌大肠杆菌O157:H7在荧光显微镜下观察的结果图；图6是本专利技术实施例中结合垫喷涂不同浓度荧光标记的菌的测试结果图；图7是本专利技术实施例中基于抗原示踪荧光试纸条测试血性大肠杆菌O157:H7细胞上清中抗体效价结果图；图8是本专利技术实施例中基于抗原示踪荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7腹水中抗体效价结果图；图9是本专利技术实施例中基于抗原示踪荧光试纸条测试出血性大肠杆菌O157:H7纯化后的抗体效价结果图。具体实施方式为了使本专利技术实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本专利技术作具体阐述。实施例：本实施例中采用的主要试剂以及主要仪器如下所示：主要试剂PVP、TWEEN-20国药集团化学试剂有限公司；样品垫、吸水垫上海金标生物科技有限公司；BSA上海杰一生物技术有限公司；FITC上海索莱宝生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)95赛多利斯；羊抗鼠洛阳佰奥通实验材料中心。主要仪器高压蒸汽灭菌锅购自日本TOMY；酶标仪SpectraMaxM2购自MolecularDevices；Nanodrop2000C购自ThermoScientific；点样仪AD6010购自BIO-DOT；恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪BioLogicTMLP358BR5057购自BIO-RAD；单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。流式细胞仪购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。一、测效价荧光试纸条组建1、试纸条组建图1是本专利技术实施例中基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价结构图。如图1所示，测效价荧光试纸条包括：样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、检测线4、质控线5，吸水垫6和PVC底板7。PVC7在最下层，其次是硝酸纤维素膜2(NC膜)，硝酸纤维素膜居于中间，两端分别连着结合垫2和吸水垫5，样品垫1连着结合垫2远离NC膜3的一端，NC膜3上具有检测线3和质控线4，检测线3靠近结合垫2一侧。此外，荧光标记的菌喷涂于结合垫2上，羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜3上形成检测线4，阳性血清或抗体喷涂于C线形成质控线4。2、标记方法筛选大肠杆菌活体标记法：大肠杆菌O157:H7活化后，挑取单菌落，接种于液体培养基中，同时加入溶于DMSO的FITC，使其终浓度为40mg/mL,于恒温摇床180rpm/min培养16h，灭活后取菌悬液，5000rpm离心5min，用无菌的PBS重悬，直至离心后的上清液澄清为止，浓缩。大肠杆菌死体标记方法：首先将液体扩大培养的大于1*108CFU/mL的细菌，离心，用交联缓冲液清洗三次，重悬。交联液配制方法为称取7.56gNaHCO3，1.06gNaCO3，7.36gNaCl，加水定容至1L。然后将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL，每次交联使用的FITC均应新鲜配制。将配制好的FITC溶液加入已采用交联液清洗过的菌液中，置于4℃暗处过液。接着加入5moL/L的NH4Cl至终浓度50mmoL/L，4℃终止反应2小时。最后将交联物5000rpm离心5min，用PBS重悬，直至离心后上清清亮为止。图2是本专利技术实施例中抗原不同标记方法测试结果图。为了研究试纸条中抗原合适的标记方法，我们采用了活体染色法和死体染色法，并对T线上的羊抗鼠抗体浓度进行了优化，1/2号试纸条T线抗体浓度采用的是1mg/mL，3/4号试纸条T线抗体浓度采用的2mg/mL，5/6号试纸条T线抗体浓度采用的3mg/mL，7/8号试纸条T线抗体浓度采用的4mg/mL，9/10号试纸条T线抗体浓度采用的是5mg/mL。如图2(a)所示，采用活体标记的方法，1、3、5、7、9号试纸条均出现条带，说明活体标记方法会造成试纸条出现假阳性结果。而采用死体染色法，如图2(b)所示，1、3、5、7、9号试纸条均未出现条带，试纸条无假阳性，2、4、6、8、10号试纸条均出现条带，且T线采用1-5mg/mL抗体浓度时，T线荧光强度增加不明显。因此对菌的标记采用死体染色法，且T线抗体浓度采用1mg/mL。3、荧光染料浓度优化图3是本专利技术实施例中不同浓度FITC标记革兰氏阴性菌大肠杆菌O157:H7流式细胞仪测试结果图，图4是本专利技术实施例中不同浓度FITC标记革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌流式细胞仪测试结果图，图5是本专利技术实施例中标记后的革兰氏阴性菌大肠杆菌O157:本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：/n其中，荧光标记的菌喷涂于所述结合垫上，羊抗鼠抗体喷涂于所述硝酸纤维素膜上形成检测线，阳性血清或抗体喷涂于C线形成质控线。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于抗原示踪快速测定单克隆抗体效价免疫荧光试纸条，具有依次排列的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于：
其中，荧光标记的菌喷涂于所述结合垫上，羊抗鼠抗体喷涂于所述硝...

【专利技术属性】
技术研发人员：方水琴，刘箐，刘程晨，田亚晨，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31