一种作物根系微生物组高通量分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种作物根系微生物组高通量分离培养方法，包括如下步骤：S1梯度稀释分离培养作物根系细菌；S2提取培养细菌的DNA；S3对DNA分孔进行两步PCR，第一步以799F和1193R为引物，第二步以含有孔barcode的799F‑2和板barcode的1193R‑2为引物，扩增16S可变区V5‑V7得到细菌鉴定文库；S4测序分析；S5构建作物根系微生物组。本发明专利技术的方法可以用较少人力、在较短时间内分离培养大量的细菌，并通过“一键式”序列分析流程快速鉴定细菌的种类，且可组配作物根系微生物组，为获得更多的作物根系微生物资源提供了技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种作物根系微生物组高通量分离培养方法
本专利技术涉及生物
中一种作物根系微生物组高通量分离培养方法。
技术介绍
植物在进化过程中，从水生到陆生生活方式的转变形成了根系组织，帮助植物从土壤中获得营养和水分。土壤中栖息着大量且种类繁多的微生物，这些微生物被植物的根系选择并富集，形成根系微生物组，它们伴随植物的整个生长周期，参与植物的生长发育、营养吸收以及抗病抗逆等重要的生理过程。植物与根系微生物组的相互作用与农作物营养高效利用、连作、轮作等重要农业问题密切相关。植物与根系微生物组互作涉及植物分子生物学(微观)和土壤环境因素(宏观)，是一个极其复杂的过程。高通量测序技术虽然能够有效地检测根系微生物组的组成，但根系微生物组与宿主植物互作的功能研究还较少。由于微生物培养技术的限制，大量与植物共生的微生物无法进行纯化培养，仅依赖于测序技术的描述性工作，大大制约了对微生物在植物中的功能以及植物与根系微生物组互作过程分子机制的研究。1982年，Colwell实验室提出活的但不可培养微生物的概念，指出自然界中存在着大量的尚未能在实验室中分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种作物根系微生物组高通量分离培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/nS1、在无菌条件下，研磨作物根系得到作物根系匀浆物，采用梯度稀释法稀释所述作物根系匀浆物得到多个稀释度样品，将每个稀释度样品在N张96孔板上培养，直至所有稀释度样品的浑浊的孔数目不再增加为止；留浑浊的孔数占对应稀释度样品接种的总孔数比例为30-50％的稀释度样品培养得到的浑浊孔，每个浑浊孔内的液体含有细菌，将所述每个浑浊孔内的液体命名为培养细菌；所述N为大于等于2的自然数；/nS2、在无菌条件下，提取每个所述培养细菌的基因组DNA；/nS3、在无菌条件下，将每个所述培养细菌的基因组DNA作为模板，以799F和11...

【技术特征摘要】
1.一种作物根系微生物组高通量分离培养方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
S1、在无菌条件下，研磨作物根系得到作物根系匀浆物，采用梯度稀释法稀释所述作物根系匀浆物得到多个稀释度样品，将每个稀释度样品在N张96孔板上培养，直至所有稀释度样品的浑浊的孔数目不再增加为止；留浑浊的孔数占对应稀释度样品接种的总孔数比例为30-50％的稀释度样品培养得到的浑浊孔，每个浑浊孔内的液体含有细菌，将所述每个浑浊孔内的液体命名为培养细菌；所述N为大于等于2的自然数；
S2、在无菌条件下，提取每个所述培养细菌的基因组DNA；
S3、在无菌条件下，将每个所述培养细菌的基因组DNA作为模板，以799F和1193R为引物，分别进行PCR扩增16SrRNA基因V5-V7片段，将该PCR称为第一步PCR；将得到的第一步PCR产物作为模板，以799F-2和1193R-2为引物进行PCR扩增16SrRNA基因V5-V7片段，将该PCR称为第二步PCR；收集每个所述培养细菌的第二步PCR产物并进行混合得到所有培养细菌的第二步PCR产物混合物，将该混合物称为培养细菌鉴定文库；
所述799F为核苷酸序列是序列1的单链DNA，所述1193R为核苷酸序列是序列2的单链DNA，所述799F-2和1193R-2选自下述A或B的引物：
A、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA；
B、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA；
所述96个孔barcode是用于标记在一张96孔板上的96个孔的标记，所述96个孔barcode的核苷酸序列均不相同，所述M个板barcode是用于标记所述N张96孔板的标记，所述M个板barcode的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：白洋，张婧赢，刘永鑫，曲宝原，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11