苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法技术

本发明专利技术公开了一种结合光化学衍生和串联质谱分析对脂质双键位置进行结构解析的方法。脂质脂肪链上的双键在254纳米紫外光激发下会与苯乙酮衍生物2’,4’,6’‑三氟苯乙酮(triFAP)或4’‑三氟甲基苯乙酮(FMAP)发生高效的Paternò‑Büchì(PB)反应，形成一对含四元环结构的异构体产物。在串联质谱中，该对异构体产物能产生一对质荷比固定的诊断离子，从而用于碳碳双键位置的确定。对于同时含有多个碳碳双键位置异构体的脂质，利用诊断离子的强度比例，可以直接得出各异构体的相对含量。该方法可与鸟枪法或液相色谱分离相结合，实现对复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。

【技术实现步骤摘要】
苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法
本专利技术涉及质谱分析
，具体而言，涉及苯乙酮衍生物应用于不饱和脂质分析的方法，更具体地，涉及利用脂质与苯乙酮衍生物经光反应得到的产物在质谱中特征的破碎行为，来对其精细结构进行高通量的质谱检测分析。
技术介绍
脂质是细胞膜的重要结构支架，参与多种细胞信号传递和代谢过程，其中一个重要的亚类，不饱和脂质，特征为至少有一个碳碳双键(C＝C)在烷基链上分布。相关研究表明不饱和脂质的分布在分泌途径涉及的相关细胞器中和一些分化结构如神经轴突中呈现规律性变化；且C＝C异构体比例已证实在乳腺癌细胞和T2D型患者的体液中会存在异常变化，是潜在的疾病生物标志物。因此，不饱和脂质的鉴定具有重要意义，而以一种灵敏和高通量的方式精确定位C＝C的位置则是一个挑战。质谱是一种常见的分析检测手段，其高灵敏度，高选择性以及高通量的特征使得它在脂质组学的应用上受到越来越多的关注。近几年，随着直接进样的“鸟枪法脂质组学”和基于分离的“液相色谱-质谱方法”的发展，脂质的精确结构解析以及精确结构所引起的生物学作用逐渐成为研究的热点。虽然高分辨率质谱法很容易获得脂质分子的精确分子组成，确定脂质的种类，但串联质谱法仍然是脂质深层结构表征最直观确定的手段。为了解决定位C＝C这一问题，多种质谱(MS)方法和化学衍生化策略被设计和发展，如臭氧诱导离解(OzID)、紫外光解离(UVPD)、间氯氧化苯甲酸(m-CPBA)环氧化反应与碰撞诱导解离(CID)-MS/MS等。但是，受仪器修改和复杂性要求的限制，它们在脂质组学中的应用还不十分广泛。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出不饱和脂质分析方法。该方法可与鸟枪法或液相色谱分离相结合，实现对复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。专利技术人前期开发了一种可与串联质谱联用的C＝C特异性修饰方法(PB-MS/MS)。该方法利用丙酮和C＝C之间的Paternò-Büchì反应(PB反应，PBRxn)实现快速双键衍生，可与鸟枪和液相色谱脂质组学相兼容，并已成功应用于脂肪酸、甘油磷脂和胆固醇酯的分析。实际上，丙酮作为一种常见的溶剂，与质谱仪相容性好，能实现相对较低的检测限。但是，丙酮PB-MS/MS仍存在一些缺陷，如丙酮的NorrishⅠ型裂解产生的化学干扰；受反应转化率限制，小分子量(58Da)标签导致的复杂样品中反应物和产物的重叠。因此，需要开发新的试剂及衍生化方法，来提高PB-MS/MS的应用性。鉴于此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种不饱和脂质分析方法。根据本专利技术的实施例，该不饱和脂质分析方法包括：(1)配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；(2)在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；(3)基于所述2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或所述4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过所述质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。专利技术人在研究中发现，2’,4’,6’-三氟苯乙酮(简称TriFAP，分子量174)或4’-三氟甲基苯乙酮(简称FMAP，分子量188)可以在紫外光作用下与脂质发生衍生化反应，在质谱中主要表现为反应后一级质谱图会出现+174Da(TriFAP)或+188Da(FMAP)的新峰，转化率大约在35～40％。对检测到的脂质与苯乙酮衍生物的反应物做串联质谱分析，二级谱图中除了脂质本身的碎片外，主要可以看到诊断离子对(质荷比相差142Da或156Da)、失水峰(-18Da)和试剂的中性丢失峰(-174Da或-188Da)，双键位置的诊断主要依赖于诊断离子对。在紫外光激发下，苯乙酮衍生物会与脂质双键反应产生含氧四元环，在质谱的碰撞诱导解离(CID)作用下，含氧四元环会沿着与合成方向相垂直的方向发生裂解，生成新的烯烃结构和羰基结构，质谱图中即可以观察到头基部分含电荷的碎片离子。由于进攻方向的不同，生成的含氧四元环有两种，针对每个双键也就可以观察到一对碎片离子，这一对碎片离子的质荷比存在固定的差值，从而可以用来对双键的位置进行判断。由此，该方法可以实现复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析，为寻找新的生物标记物提供了方向，为未来临床样品的生物诊断提供了更全面的脂质解析。另外，根据本专利技术上述实施例的不饱和脂质分析方法还可以具有如下附加的技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述脂质样品为不饱和脂质标准品或含有不饱和脂质的复杂生物样品。在本专利技术的一些实施例中，所述紫外光的波长为254nm。在本专利技术的一些实施例中，所述衍生化反应进行的时间为2～25s。在本专利技术的一些实施例中，所述质谱分析中采用碰撞能量为30～45eV。在本专利技术的一些实施例中，所述质谱分析中采用仪器为三重四极杆质谱仪或beam-typeCID质谱仪。在本专利技术的一些实施例中，所述质谱分析的进样方式为鸟枪法、直接进样法或液相色谱-质谱联用法。在本专利技术的一些实施例中，所述不饱和脂质分析方法进一步包括：根据所述诊断离子的总强度比与脂质样品中碳碳双键异构体含量比，建立碳碳双键异构体的相对定量曲线。在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了上述实施例的不饱和脂质分析方法在分析牛肝提取物中的用途。如前所述，本专利技术提出的不饱和脂质分析方法可以实现复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析。专利技术人将该不饱和脂质分析方法应用于牛肝提取物的分析中，通过该结构解析流程，在牛肝脏极性脂质提取物中鉴定了194个不饱和脂质分子，其中包括41对双键异构体。由此可见，不饱和脂质分析方法实现了复杂样品中的脂质高通量、高灵敏、精细结构解析，为寻找新的生物标记物提供了方向，为未来临床样品的生物诊断提供了更全面的脂质解析。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为根据本专利技术一个实施例的用于PB反应的离线微流光反应器装置示意图；图2a为PC16:0/18:1(5μM)和2mMtriFAP反应后的一级质谱图；图2b为PC16:0/18:1反应产物的CID谱图(碰撞能量在40eV左右)；图2c为PC16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为一级谱中的m/z934.6；图2d为PC16:0/18:1反应产物经反相色谱柱分离后的色谱图，提取离子为二级谱中的碎片离子m/z918.6(B),m/z760.6(Y),m/z792.5(R)和m/z650.5(G)；图2e-h为色谱图中14.5-19.5min对应的CID谱图；图3a为PC16:0/18:1(5μM)和2mMFMAP反应后的一级质谱图；图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不饱和脂质分析方法，其特征在于，包括：/n(1)配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；/n(2)在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；/n(3)基于所述2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或所述4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过所述质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。/n

【技术特征摘要】
1.一种不饱和脂质分析方法，其特征在于，包括：
(1)配制含2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮的脂质样品溶液；
(2)在紫外光作用下，使脂质样品与2’,4’,6’-三氟苯乙酮或4’-三氟甲基苯乙酮发生衍生化反应，得到2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物，或4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物；
(3)基于所述2’,4’,6’-三氟苯乙酮衍生化产物或所述4’-三氟甲基苯乙酮衍生化产物进行质谱分析，通过所述质谱分析中产生的诊断离子，判断脂质中碳碳双键的位置。


2.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述脂质样品为不饱和脂质标准品或含有不饱和脂质的复杂生物样品。


3.根据权利要求1所述的不饱和脂质分析方法，其特征在于，所述紫外光的波长为254nm。


4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑕瑜，赵婧，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11