一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法技术

一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，在聚苯乙烯‑丙烯酸纳米球上自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。本发明专利技术检测线性范围宽、灵敏度高、稳定性强。

【技术实现步骤摘要】
一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法
本专利技术专利属于生物检测
，具体涉及免疫电化学分析方法在土壤/水界面研究中的应用，尤其涉及一种检测大肠杆菌的电化学方法。
技术介绍
土壤中含有的大量微生物并不都是以游离态存在于土壤中，大约80–90%的微生物被束缚在固相表面。在土壤和水生环境中，细菌与土壤矿物之间的相互作用对细菌的转运和最终命运产生重要影响，并且它们的相互作用对土壤的物理、化学和生物学性质都具有重要的影响，例如矿物形成与风化、有机物质分解和团聚体形成。粪源性有机肥施入土壤中，往往有大肠杆菌的引入，为了评估大肠杆菌与土壤之间的相互作用，开展大肠杆菌在土水界面上的分配研究十分必要。在界面研究过程中，需要分离检测游离的大肠杆菌。检测大肠杆菌的传统方法主要有平板计数法、分光光度比浊法等。平板计数需要培养细菌，方法操作复杂，需要专业操作人员等缺点，不适合在研究大肠杆菌与土壤相互作用研究的测定中。分光光度比浊法，需要首先通过使用密度梯度离心法，运用蔗糖溶液分离游离态和矿物结合态细菌，游离部分的细菌全部转移后通过紫外可见分光光度法测定。但是由于分离过程中溶液体积发生变化和大肠杆菌与土壤胶体分离不清，同时土壤矿物在溶液中散射作用，因此传统方法测定具有一定的弊端。特别是在高浓度的未吸附的大肠杆菌与土壤胶体密度相差不大，界面不易分离，通过全部转移后定容，损失了分离不清的未吸附的大肠杆菌，从而导致传统方法测定浓度偏低；而电化学检测法作为一种高效，简单，准确，快速的分析方法，在分析领域引起了广泛关注。大肠杆菌可以与制备的电化学传感器进行免疫后，通过电信号的变化来进行大肠杆菌的定量检测。电化学方法可以直接测定的为上层未吸附的大肠杆菌的浓度，从而提高了测定准确度。本专利技术公开一种检测大肠杆菌的电化学方法并应用于检测土水界面中大肠杆菌，具有非常重要的科研意义和应用价值。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术公开了一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法。以壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极构建传感平台，自组装大肠杆菌抗体，通过大肠杆菌抗体与大肠杆菌免疫作用，捕获溶液中的大肠杆菌，进而通过葡萄糖氧化酶和抗-大肠杆菌抗体功能化聚苯乙烯-丙烯酸功能化纳米探针进行信号放大。本方法为线性范围宽、灵敏度高、稳定性强的大肠杆菌检测方法，并将这种大肠杆菌传感器运用在大肠杆菌在土壤/水界面研究中。技术方案：一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，步骤为：a.功能纳米探针的制备：在聚苯乙烯-丙烯酸纳米球上层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；b.电化学免疫传感平台的构建：利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；c.检测土水界面大肠杆菌：当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。上述聚苯乙烯-丙烯酸纳米球的制备方法为：按比例，首先在容器中加入80mL超纯水，在氮气气氛中200rpm油浴搅拌；持续充入N245min后，将0.4g丙烯酸和4g苯乙烯加入到容器中并加热；当温度达到70℃后，向容器中加入20mL0.01g·mL-1的过硫酸铵回流6.5h，然后在13000rpm下离心20min得聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，用超纯水清洗聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，最后用超纯水定容到12mL并放于4℃下保存。上述带正电的质子化的壳聚糖的制备步骤为：称取0.5g壳聚糖后滴加50mL1%冰醋酸得到1%壳聚糖溶液，再用纯水稀释10倍，得到0.1%壳聚糖溶液。上述带负电的金纳米粒子的制备步骤为：称取0.0210g氯化金溶于210mL超纯水中，加热到沸腾，加入9.45mL1%柠檬酸三钠，继续沸腾10分钟，颜色经过蓝色，红色，橙红三个过程，得到0.01%金纳米粒子。上述层层自组装的步骤为：按比例，将5mL0.1%壳聚糖溶液与150μL聚苯乙烯-丙烯酸纳米球溶液混合搅拌30min，然后在8000rmp下离心20min，得到固体后加入5mL0.01%金纳米粒子溶液搅拌30min，然后在8000rmp下离心20min，并用超纯水清洗三次，最后用超纯水定容至6mL，并放于4℃下保存。上述探针的具体制备步骤为：向1mL组装了壳聚糖和金纳米粒子的纳米球溶液中加入50μL5gL-1的葡萄糖氧化酶和50μL100μgmL-1大肠杆菌抗体混合搅拌1小时；最后在8000rmp下离心20min，并用超纯水清洗三次，并用超纯水定容至1mL，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针，置于4℃冰箱中保存。上述电化学免疫传感平台的构建，具体步骤为：首先在经过预处理过的玻碳电极表面滴加10μL0.1%壳聚糖溶液壳聚糖后晾干，再滴加10μL0.06gL-1二茂铁二甲酸后晾干，再滴加10μL0.01%的金纳米粒子后凉干；再滴加10μL100µg/mL大肠杆菌抗体。上述经过预处理过的玻碳电极的制备步骤为：打磨玻碳电极表面至镜面后，使用1:1稀释的HNO3溶液、95%的乙醇、18.2MΩ.cm超纯水分别超声清洗5min；然后用0.5MH2SO4对电极进行循环伏安扫描，直至电极的循环伏安图稳定；最后再分别用95%的乙醇、超纯水超声清洗5min，最后用氮气吹干备用。上述检测土水界面大肠杆菌的步骤为：滴加20μL待测液或者大肠杆菌标准曲线溶液，在37℃的培养箱中保温免疫30min；滴加10μL合成的功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米探针进行信号放大，在37℃的培养箱中保温二次免疫30min；采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测大肠杆菌；以修饰过的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以含有5mmol/L葡萄糖的PBS缓冲电解质液中为检测底物，应用电化学工作站，以扫描速度为50mV/s，在扫描电位范围0.1-0.6V下进行检测，观察峰型变化，记录电流值，表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。上述土水界面大肠杆菌的分离方法为：在土壤与土壤表面溶液的溶液达到吸附平衡后，通过4000rpm下离心5min分离土水界面。有益效果：通过大肠杆菌抗体与大肠菌的免疫作用，进而通过葡萄糖氧化酶和抗-大肠杆菌抗体功能化聚苯乙烯-丙烯酸功能化纳米探针进行信号放大，提高检测灵敏度；同时通过将二茂铁二甲酸修饰固定在玻碳电极的表面，与二茂铁二甲酸修饰在液体或悬液中相比，结合力更强，可提供更为稳定的催化平台。通过部分分离游离的大肠杆菌溶液就可以准确测定体系中的游离大肠杆菌的溶度，相对传统梯度离心法，提高了操作的便捷性。本方法为线性范围宽、灵敏度高、稳定性强的大肠杆菌检测方法，在研究大肠杆菌与土壤或者矿物相互作用，该方法可以广泛应用，为土壤与细菌作用研究提供了一个便捷可靠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于步骤为：/na.功能纳米探针的制备：在聚苯乙烯-丙烯酸纳米球上层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；/nb.电化学免疫传感平台的构建：利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；/nc.检测土水界面大肠杆菌：当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于步骤为：
a.功能纳米探针的制备：在聚苯乙烯-丙烯酸纳米球上层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；
b.电化学免疫传感平台的构建：利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；
c.检测土水界面大肠杆菌：当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。


2.根据权利要求1所述检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于所述聚苯乙烯-丙烯酸纳米球的制备方法为：按比例，首先在容器中加入80mL超纯水，在氮气气氛中200rpm油浴搅拌；持续充入N245min后，将0.4g丙烯酸和4g苯乙烯加入到容器中并加热；当温度达到70℃后，向容器中加入20mL0.01g·mL-1的过硫酸铵回流6.5h，然后在13000rpm下离心20min得聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，用超纯水清洗聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，最后用超纯水定容到12mL并放于4℃下保存。


3.根据权利要求1所述检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于所述带正电的质子化的壳聚糖的制备步骤为：称取0.5g壳聚糖后滴加50mL1%冰醋酸得到1%壳聚糖溶液，再用纯水稀释10倍，得到0.1%壳聚糖溶液。


4.根据权利要求1所述检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于所述带负电的金纳米粒子的制备步骤为：称取0.0210g氯化金溶于210mL超纯水中，加热到沸腾，加入9.45mL1%柠檬酸三钠，继续沸腾10分钟，颜色经过蓝色，红色，橙红三个过程，得到0.01%金纳米粒子。


5.根据权利要求1所述检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于所述层层自组装的步骤为：按比例，将5mL0.1%壳聚糖溶液与150μL聚苯乙烯-丙烯酸纳米球溶液混合搅拌30min，然后在8000rmp下离心20min，得到固体后加入5mL0.01%金纳米粒子溶液搅拌30min，然后在8000rmp下离心20min，并用超...

【专利技术属性】
技术研发人员：王如海，唐昊冶，徐仁扣，钱薇，洪志能，韩恩，
申请(专利权)人：中国科学院南京土壤研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32