一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用，外泌体miRNA分子标志物包括ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p和ssc‑miR‑149，单独使用血清外泌体miRNA诊断区分早期妊娠与未妊娠母猪时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.863、0.885、0.857；ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p联合AUC为0.921；ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑149联合AUC为0.902；ssc‑miR‑146a‑5p、ssc‑miR‑149联合AUC为0.910，ssc‑miR‑192、ssc‑miR‑146a‑5p、ssc‑miR‑149三种miRNA联合时，其AUC为0.959，可见，本发明专利技术提供的外泌体miRNA分子标志物在早期母猪妊娠诊断中具有高灵敏度及高特异性，使用多个miRNA标志物联合，具有优越的诊断性能。

【技术实现步骤摘要】
一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用
本专利技术属于生物技术诊断领域，具体的，本专利技术涉及一种用于母猪妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。
技术介绍
外泌体(Exosomes)是细胞产生释放到细胞外环境大小为30-100nm的囊泡，普遍存在于动物的唾液、血液、尿液及乳汁等流体中。microRNAs(miRNA)是短链非编码RNA，其长度约为19-22个核苷酸，通过与mRNA的3'-UTR区内部分或全部序列互补发挥调控作用，导致靶基因转录抑制，从而参与动物的胚胎发育。miRNA存在于外泌体的独特形式使之成为理想的生物标志物。研究表明，Exosomes作为细胞外miRNA的一种运载形式，可以保护其内miRNA免受核糖核酸酶的降解，使得miRNA在Exosomes中高度稳定表达。Exosome中的miRNA拥有独特的介导细胞间通信的作用，可以特异性抑制细胞中与其对应靶基因的表达。Exosomes中miRNA的在体液中独特稳定性和时空特异性使之成为理想的新型生物标志物逐渐进入人们的视野中。母猪的妊娠诊断一直以来都受到企业的重视，因为早期妊娠的准确诊断不仅可以缩短母猪的非生产天数(NPD)，而且还可以提高年产窝仔数和增加窝均断奶仔猪数。如何通过有效而准确的诊断方法发现未妊娠母猪，缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)一直困扰着养猪业。现有的妊娠诊断方法存在着各自的缺陷，如超声波诊断受使用者的经验程度及其检测天数较长的影响；依据母猪发情周期以及妊娠征状诊断，可能会存在假发情现象；激素测定则存在一定的危险性。目前还没有一种能在妊娠早期(特别是妊娠21天以内，即配种后未妊娠母猪能再次发情的时间)进行妊娠诊断的有效方法进入实用阶段。鉴于以上诊断方法存在的缺陷，我们迫切的需要找到一种更为简单准确的妊娠诊断方法应用于生产管理。目前关于母猪妊娠早期妊娠外泌体miRNA的研究较少，普遍存在特异性和灵敏度低、诊断价值低的问题，如何通过研究外泌体miRNA，对血清外泌体miRNA作为妊娠诊断分子标志物的研究对养殖业具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物的特异性和灵敏度低、诊断价值低的技术问题，本专利技术旨在于提供一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物。本专利技术收集了14天配种妊娠与未妊娠母猪外周血样本，通过采用新一代高通量测序技术，结合系统的生物信息学分析方法，对妊娠与未妊娠母猪样本中差异外泌体miRNA进行筛选，最终获得了3个与母猪早期妊娠密切相关的外周血中外泌体miRNA，即ssc-miR-192、ssc-miR-149和ssc-miR-146a-5p，选择3个外泌体miRNA中的任意一个或两个以上的组合，在配种后妊娠与未妊娠母猪血清样本中的表达量均存在显著差异并通过Real-timePCR验证，最终证明本专利技术提供的ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149与母猪早期妊娠高度相关，能够作为快速检测母猪早期妊娠的标志物，该种血清外泌体miRNA标志物具有良好的诊断指标的特性。本专利技术中，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-149的RNA序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示：SEQIDNO.1：CCGACAGUUAAGUAUCCAGUC；SEQIDNO.2：UUGGGUACCUUAAGUCAAGAGU；SEQIDNO.3：UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC。本专利技术中，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-149的正向引物分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示：SEQIDNO.4：TCCCTGACCTATGAATTGACAGC；SEQIDNO.5：TTGAGAACTGAATTCCATGGGTT；SEQIDNO.6：TCTGGCTCCGTGTCTTCACTC。反向引物为TIANGEN公司设计并合成的通用下游引物，该引物包含在TIANGEN公司的miRcutePlusmiRNAqPCRKit(SYBRGreen)试剂盒中。本专利技术中，采用ssc-U6作为内参基因，其中，内参引物ssc-U6-F、ssc-U6-R序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示：SEQIDNO.7:CGCTTCGGCAGCACATATACTA；SEQIDNO.8：ATGGAACGCTTCACGAATTTGC。同时，本专利技术提供一种外泌体miRNA标志物的检测试剂盒，该种试剂盒包括用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物和PCR技术常用的试剂，外泌体miRNA标志物选择ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149三种miRNA标志物的组合。优选的，试剂盒中的检测试剂包括2×miRNARTReactionBuffer、miRNARTEnzymeMix、RNase-FreeddH2O、2×miRcutePlusmiRNAPreMix、ReversePrimer、miRNA第一链cDNA、50×ROXReferenceDye、75％乙醇、血清外泌体裂解液、氯仿和无水乙醇，上述检测试剂用于检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量。优选的，试剂盒中的特异性引物为检测ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149表达量的特异性引物。优选的，试剂盒中的特异性引物的RNA序列如SEQIDNO.4-SEQIDNO.6所示。进一步的，本专利技术提供外泌体miRNA标志物ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合在制备母猪早期妊娠诊断试剂盒中的应用，在母猪配种14天采集血样，采用Real-timePCR检测血清中ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的表达水平，若能检测显著低表达，则该母猪应当进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)，进而能有效降低母猪非生产天数，提高养猪企业的经济效益。本专利技术原理：申请人发现ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149在妊娠早期母猪血清外泌体中相对于配种未妊娠母猪表达量显著更高，所以本专利技术重点分析了早期妊娠母猪血清ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的成熟体(SEQIDNO：1-SEQIDNO：3所示)的表达情况，首次发现血清ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149可以单独或者组合作为快速检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物选自ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物选自ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149中的任意一种或两种以上的组合，ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p、ssc-miR-149的序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物为ssc-miR-192，ssc-miR-192的序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求1所述的一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物为ssc-miR-146a-5p，ssc-miR-146a-5p的序列如SEQIDNO.2所示。


4.根据权利要求1所述的一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物为ssc-miR-149，ssc-miR-149的序列如SEQIDNO.3所示。


5.根据权利要求1所述的一种用于母猪早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述外泌体miRNA标志物选自ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p两种的组合，其序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2。


6.根据权利要求1所述的一种用于母猪早期妊娠诊断的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄涛，高若男，李涛，邱梅玉，谢苏，孙义姗，和军飞，公红斌，陈鑫，李清春，卢世豪，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65