一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法技术

本发明专利技术提出了一种Caco‑2细胞单层膜形成培养方法：用含20％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的MEM培养基培养Caco‑2细胞，当细胞汇合度达到60％‑70％时胰酶消化，连续传代培养2‑3次，待细胞培养到对数生长期，过量接种细胞培养，细胞贴壁展开后，用PBS清洗未贴壁细胞，即得到Caco‑2单层膜细胞。本发明专利技术方法建立的Caco‑2单层膜模型状态良好，呈铺路石状镶嵌状排列，细胞之间紧密连接，基本无空泡形成，Caco‑2细胞模型可靠稳定、重复性好，为后续的药物吸收、转运研究奠定实验基础。

【技术实现步骤摘要】
一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法
本专利技术涉及细胞培养领域，尤其涉及一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法。
技术介绍
细胞是生物体基本的结构和功能单位，也是细胞学实验的研究对象，几乎所有已知的疾病都与细胞息息相关，而细胞学实验是生命科学领域研究细胞的最直接方式之一。状态良好的细胞是细胞实验最根本最重要的实验材料之一，而细胞培养技术则是保证细胞状态良好的决定性技术，已知不同来源的细胞种类已达千余种，且仍在增加，每种细胞甚至同种细胞的不同批次或代数都存在其各自最合适的培养方案。即使对于同一株细胞，针对不同的实验目的，研究者们也摸索出了侧重点各异的培养方法。人结直肠腺癌细胞(thehumancolonadenocarcinomacelllines，Caco-2细胞)来源于人类结肠和直肠癌细胞；当长满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白Ⅱ，并呈角质蛋白阳性。Caco-2细胞单层膜模型是当前研究药物对细胞作用的常用工具。目前的建模方式是根据实验目的将细胞接种到对应的培养容器中，每隔1～2天在显微镜下观察一次细胞状态，并通常在第一周每隔两天进行保守性的更换培养基操作，第二周及以后改为每天更换新鲜培养基。从接种到建模成功大约持续7～21天。从第7天开始，便可观测细胞成膜进展，显微镜下能否观察到细胞呈铺路石状镶嵌状排列是判断建模是否成功的依据之一，此外，还需辅以多次测量跨膜电阻的大小，甘露醇或荧光黄透过性试验及碱性磷酸酶活性等来最终确定建模是否成功。然而，上述建模方式存在严重的缺陷或不足，主要体现在对细胞状态的要求极为苛刻，需要细胞在全过程都处于比较良好的状态，传统成膜方法培养时间长，检测次数多，极易造成细胞状态变差或引起污染。具体地，存在以下几个方面的难点：1)如何保证接种时良好的细胞状态，这取决于细胞的低传代数和保藏、复苏、运输等技术。然而，目前细胞保藏、复苏、运输技术已成熟，能够维持细胞的现有状态；而高传代次数意味着细胞状态的下降和分化增多，会使细胞结构形态和功能发生改变，从而显著降低建模成功率，即使建模成功，分化的细胞也已不再适合其他实验的进行，并且随着时间的推移，状态良好的细胞的获取成本也将逐渐升高。2)如何维持接种后的细胞状态，Caco-2在生长过程中会成团簇生长，实验研究发现，按照已有文献的接种方式接种细胞，会在成膜之前出现大量空泡，即便有些价格高昂的血清能在一定程度上减少空泡，但效果有限。3)成膜时间长，期间需要进行多次检测，易导致细胞状态变差及细胞污染。4)如上所述，对高成本的培养条件依赖性较大。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提出了一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法，以解决Caco-2细胞单层膜形成实验周期长，状态难以保证，实验过程中出现空泡而导致实验失败的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法，包括如下步骤：S1、用完全培养基培养细胞至汇合度达到60％-70％，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞，获得单细胞悬液，按体积比例均分至两份进行下一次传代培养；S2、按照步骤S1方法进行多次传代培养；S3、待细胞培养到对数生长期，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞；S4、细胞计数，在培养板上接种细胞；S5、待细胞贴壁展开后，用PBS清洗未贴壁细胞，即得到单层膜细胞。在以上技术方案的基础上，优选的，所述完全培养基为含20％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)青霉素/链霉素的MEM培养基。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，所述传代培养次数为2-3次。在以上技术方案的基础上，优选的，所述培养条件为37℃、5％CO2恒温静置培养。在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S4中，所述接种为过量接种，包含但不限于1×106-2×106/孔(6孔板)、5×105-1×106/孔(12孔板)、2×105-5×105/孔(24孔板)。本专利技术的Caco-2细胞单层膜形成培养方法相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术通过优化Caco-2细胞培养条件及传代次数，使细胞状态得到大幅提升，从根源上保证后续实验的顺利进行；(2)本专利技术提高了接种密度，调整为过量接种，包含但不限于1×106-2×106/孔(6孔板)、5×105-1×106/孔(12孔板)、2×105-5×105/孔(24孔板)，第三天细胞贴壁充分展开后即为单层膜，大大缩短了细胞融合成单层膜的时间，细胞单层膜结构明显呈铺路石状，细胞之间紧密连接，避免了由于培养时间过长而导致形成大量空泡及由此引起的检测问题；(3)本专利技术的Caco-2细胞单层膜形成培养方法降低了对细胞状态和血清质量的依赖性，显著节约了研究成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为传统培养方法培养的Caco-2细胞形态图(100×)。图2为本专利技术方法培养的Caco-2细胞形态图(100×)。图3为传统培养方法培养Caco-2细胞单层膜形态图(100×)。图4为本专利技术方法培养Caco-2细胞单层膜形态图(100×)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术所用的试剂和原料均为公知技术，为本领域技术人员熟知的技术，而且在市场上很容易购得。下面实施例中描述的试剂和实验器具在使用前均经过灭菌处理。实施例1本实施例提供了一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法，具体如下：Caco-2细胞用含20％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)青霉素/链霉素的MEM培养基于37℃、5％CO2恒温静置培养，当细胞汇合度达到60％时(1-2d)，去除培养基并加入胰酶消化3min，再加入新鲜培养基，轻柔地充分吹打细胞，获得单细胞悬液，按体积比例均分至两份进行下一次传代培养，如此连续传代培养2次。待细胞培养到对数生长期，于显微镜下观察细胞形态并拍照。去除培养基并加入胰酶消化3min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞。用细胞计数板计数，接种于6孔培养板上，接种量为1×106/孔。待细胞贴壁展开后，用PBS清洗未贴壁细胞2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、用完全培养基培养细胞至汇合度达到60％-70％，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞，获得单细胞悬液，按体积比例均分至两份进行下一次传代培养；/nS2、按照步骤S1方法进行多次传代培养；/nS3、待细胞培养到对数生长期，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞；/nS4、细胞计数，在培养板上接种细胞；/nS5、待细胞贴壁展开后，用PBS清洗未贴壁细胞，即得到单层膜细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种Caco-2细胞单层膜形成培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、用完全培养基培养细胞至汇合度达到60％-70％，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞，获得单细胞悬液，按体积比例均分至两份进行下一次传代培养；
S2、按照步骤S1方法进行多次传代培养；
S3、待细胞培养到对数生长期，去除培养基并加入胰酶消化3-5min，再加入完全培养基，轻柔地充分吹打细胞；
S4、细胞计数，在培养板上接种细胞；
S5、待细胞贴壁展开后，用PBS清洗未贴壁细胞，即得到单层膜细胞。


2.如权利要求1所述的Caco-2细胞单层膜形成培养方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，吴娟，李弘泽，严睿韬，寇小娟，
申请(专利权)人：武汉巴菲尔生物技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42