一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法技术

本发明专利技术公开了一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，属于植物组织培养领域。包括步骤：采集枝条上的叶片作为外植体；对叶片消毒后进行切割诱导形成愈伤组织；不定芽诱导培养；生根培养；进行移植。本发明专利技术本发明专利技术采用植物组织培养技术建立了柄翅果实生幼苗叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其叶片愈伤组织诱导达到了73％以上，移植成活率达到了83％以上。本发明专利技术具有周期短、成本低廉、繁殖系数高、种苗生长一致等特点，可直接用于柄翅果种苗的工厂化生产，对于促进柄翅果的推广种植具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法。
技术介绍
柄翅果，学名：Burretiodendronesquirolii(Levl.)Rehd.，渐危种，属于国家Ⅱ级重点保护野生植物。由于乱砍滥伐，现仅散见于次生林中，以柄翅果占优势的天然林已很难找到。柄翅果在天然林中，常是林分的上层林木；在疏林中林内幼树较多，与其他植物组成较大群落时，具有较大的稳定性；在罗甸羊里地区，柄翅果常与车筒竹、白腊树、来树、楝树、余甘子、石岩枫、杭子梢、假烟叶树等种类组成林分。柄翅果尚未进行大量引种试验和种子育苗繁殖方法。当果实由绿色变为褐色时即可采摘，将其在通风干燥处荫干，不宜爆晒或堆沤，宜随采随播或湿砂贮藏，若干藏则在短期内种子完全丧失发芽力。然而，有性繁殖存在着分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而组织培养却能保证后代的相对一致和提高遗传增益。目前，国内外尚未有柄翅果组织培养技术的相关研究。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，能够实现柄翅果苗木的规模化生产。为实现本专利技术目的，通过以下技术方案予以实现：一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，以下步骤：(1)外植体采集：采集枝条上的叶片作为外植体；(2)叶片愈伤组织诱导培养：对叶片消毒后进行切割诱导形成愈伤组织；(3)不定芽诱导培养：对愈伤组织进行不定芽培养，得到不定芽芽丛；(4)生根培养：对不定芽芽丛进行生根培养，得试管苗；(5)移植：将试管苗进行移植，得种苗。优选地，所述步骤(1)，在一年生柄翅果枝条上采集叶片作为外植体。优选地，所述步骤(2)中，先对叶片用水冲洗，然后浸泡在乙醇中，再使用H2O2消毒并用水冲洗；最后将消毒后的叶片进行切割，并将其叶面朝上水平接种到叶片愈伤组织诱导培养基中培养至少30天。进一步优选地，所述叶片愈伤组织诱导培养基的条件为：N6培养基，3.0mg/L核黄素，0.5mg/LPVP，1.0mg/L2,4-D，0.5mg/LNAA，0.5mg/L活性碳，30g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH为5.4-5.8。优选地，所述步骤(3)中，将愈伤组织中与叶片愈伤组织诱导培养基接触的部分切除后，移植到不定芽诱导培养基中培养至少25天。优选地，所述不定芽诱导培养基的条件为：N6培养基，4.0mg/L核黄素，0.5mg/LPVP，0.5mg/L6-BA，0.1mg/LNAA，0.5mg/L活性碳，30g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH值为5.4-5.8。优选地，所述步骤(4)中，将定芽芽丛分成单个的不定芽后将不定芽接种到生根培养基中培养至少20天。进一步优选地，所述生根培养基的条件为：1/2MS培养基，0.5mg/LIBA，1.0mg/LNAA，35g/L蔗糖，4.0g/L琼脂，pH值为5.4-5.8。优选地，所述步骤(5)中，将试管苗移植至温室大棚中炼苗至少10天，然后再试管苗洗净根部的培养基移植于砖红壤、腐质土基质的混合土壤中栽培成苗即得柄翅果种苗。优选地，在步骤(2)中，培养条件为：温度26-30℃，光照强度为2800-3000lx，光照时间为12-14小时/天；湿度60％-70％；在步骤(3)和步骤(4)中，培养条件为：温度25-28℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时/天；湿度60％-70％。本专利技术本专利技术采用植物组织培养技术建立了柄翅果实生幼苗叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其叶片愈伤组织诱导达到了73％以上，移植成活率达到了83％以上。本专利技术具有周期短、成本低廉、繁殖系数高、种苗生长一致等特点，可直接用于柄翅果种苗的工厂化生产，对于促进柄翅果的推广种植具有重大意义。具体实施方式下面具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，对本专利技术上述结构做出的其它多种形式的修改、替换或变更，均应落在本专利技术的保护范围。本专利技术中所使用的tween-20是一种非离子型表面活性剂，又称聚山梨酯-20(Polysorbate-20)；PVP是指聚乙烯吡咯烷酮；2,4-D是指二氯苯氧乙酸；NAA是指萘乙酸；6-BA是指6-苄氨基嘌呤；IBA是指吲哚丁酸,；1/2MS培养基是指是把其中的成分减少到原来的1/2的MS培养基。实施例1(1)外植体采集：用剪刀采集生理状态良好、无病虫害的直径为5-10mm,长15cm左右的一年生柄翅果枝条，从采集的枝条上取叶片作为外植体。(2)叶片愈伤组织诱导培养：将步骤(1)采集回实验室的叶片中选择幼嫩的且没有伤痕小叶，用自来水下冲洗3小时，置于超净工作台中于70％的乙醇溶液中消毒2次，每次20秒钟，之后用10％的H2O2(其中滴2滴Tween-20)搅拌消毒2次，每次3分钟，最后用无菌水冲洗5-7次直到冲洗干净为止。将经过消毒的柄翅果叶片切成5mm×5mm的小块，然后将其叶面朝上水平接种到叶片愈伤组织诱导培养基中，培养30天即可诱导形成愈伤组织，诱导率达81％。所述的叶片愈伤组织诱导培养基为：N6培养基+3.0mg/L核黄素+0.5mg/LPVP+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LNAA+0.5mg/L活性碳+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值为5.4-5.8。(3)不定芽诱导培养：将步骤(2)诱导的叶片愈伤组织从培养瓶中取出，用刀片削去与培养基接触的组织，然后切割成0.5cm×0.5cm大小的小块接种到不定芽诱导培养基中培养25天即可产生不定芽。所述的不定芽诱导培养基为：N6培养基+4.0mg/L核黄素+0.5mg/LPVP+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.5mg/L活性碳+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH值为5.4-5.8。(4)生根培养：从步骤(3)得到的长约2.0-3.0cm的不定芽芽丛分成单个不定芽接种到生根培养基中培养20天即能实现试管苗的生根。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/LIBA+1.0mg/LNAA+35g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH值为5.4-5.8。(5)移植：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室大棚的自然光下炼苗10天，洗净根部的培养基移植于体积比为1:1的砖红壤、腐质土基质中栽培成苗即得柄翅果种苗，移植15天后成活率达到90％以上。在上述的柄翅果的组织快繁方法中，叶片愈伤组织诱导培养的条件是培养温度为28±2℃，光照强度为2800-3000lx，光照时间为12-14小时/天，湿度60％-70％。不定芽诱导培养操作、生根培养操中培养条件均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于包括以下步骤：/n(1)外植体采集：采集枝条上的叶片作为外植体；/n(2)叶片愈伤组织诱导培养：对叶片消毒后进行切割诱导形成愈伤组织；/n(3)不定芽诱导培养：对愈伤组织进行不定芽培养，得到不定芽芽丛；/n(4)生根培养：对不定芽芽丛进行生根培养，得试管苗；/n(5)移植：将试管苗进行移植，得种苗。/n

【技术特征摘要】
1.一种柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体采集：采集枝条上的叶片作为外植体；
(2)叶片愈伤组织诱导培养：对叶片消毒后进行切割诱导形成愈伤组织；
(3)不定芽诱导培养：对愈伤组织进行不定芽培养，得到不定芽芽丛；
(4)生根培养：对不定芽芽丛进行生根培养，得试管苗；
(5)移植：将试管苗进行移植，得种苗。


2.根据权利要求1所述的柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于：所述步骤(1)，在一年生柄翅果枝条上采集叶片作为外植体。


3.根据权利要求1所述的柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，先对叶片用水冲洗，然后浸泡在乙醇中，再使用H2O2消毒并用水冲洗；最后将消毒后的叶片进行切割，并将其叶面朝上水平接种到叶片愈伤组织诱导培养基中培养至少30天。


4.根据权利要求3所述的柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于：所述叶片愈伤组织诱导培养基的条件为：
N6培养基，3.0mg/L核黄素，0.5mg/LPVP，1.0mg/L2，4-D，0.5mg/LNAA，0.5mg/L活性碳，30g/L蔗糖，7.0g/L琼脂，pH为5.4-5.8。


5.根据权利要求1所述的柄翅果叶片愈伤组织诱导茎芽扩繁的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将愈伤组织中与叶片愈伤组织诱导培养基接触的部分切除后，移植到不定芽诱导培养基中培养至少25天。


...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫昭展，黄远抗，卢娟，
申请(专利权)人：玉林师范学院，
类型：发明
国别省市：广西;45