一种用于检测人血清中Pb制造技术

本发明专利技术属于生物传感器技术领域，涉及一种用于检测人血清中Pb

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器
本专利技术属于生物传感器
，涉及一种用于检测人血清中Pb2+浓度的荧光增强型传感器及其荧光分析法。
技术介绍
铅为重金属污染物之一，铅离子的超标严重影响了人类生活环境及健康。美国环境监测部门规定饮用水中铅离子标准为15ppb(15ngmL-1；72.4nM)(Li,C.L.；Huang,C.-C.；Chen,W.-H.；Chiang,C.-K.；Chang,H.-T.,PeroxidasemimickingDNA–goldnanoparticlesforfluorescencedetectionoftheleadionsinblood.Analyst137(22),5222.)。对于检测铅离子，已经开发出的检测方法有电化学法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法，然而这些方法因耗能大、操作繁杂、不能快速检测，有一定局限性。荧光光谱法具有开发简单，灵敏，低耗时，低耗能等优点，因此被广泛应用于铅离子的检测。研究人员利用功能核酸适体具有简易，灵敏，高选择性等优点，开发出了基于功能性核酸适体的多种多样检测铅离子的荧光传感器。但目前针对人血清样品中Pb2+含量的检测灵敏度不够理想，需要寻找更加理想的核酸适体荧光传感器。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种灵敏度高、抗干扰能力强的核酸适体荧光传感器，将其用于人血清中Pb2+浓度的检测。为实现本专利技术目的，技术方案如下：由两条部分互补DNA链T30695、Z作为适体(DNA碱基序列见表1)，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(AMT)荧光染料作为传感指示剂。AMT自身在缓冲溶液中具有强荧光，而其与G-四连体结合后荧光极大猝灭，两条适配体在充分孵育后能够形成更加稳定的平行G-四链体，从而紧密的结合荧光染料AMT并使其荧光猝灭。向构建好的传感体系中加入目标检测物铅离子时，铅离子结合力(logK≈7)强于AMT与G-四链体结合力(logK≈5)。使得体系中加入Pb2+后，Pb2+与G-四链体特异性结合置换出G-四链体-AMT中的AMT，形成反平行G-四链体-Pb2+，同时AMT被释放，体系荧光增强，达到检测目的。本专利技术所构建传感体系反应机理见图1。荧光指示剂AMT作为指示剂结构式如下：圆二色(CD)光谱广泛用于表征DNA的二级结构。由于G-四链体具有特征CD信号，因此CD光谱用于验证假设的传感机理，图3为该体系下圆二色谱表征图。图3A中(1)为T30695圆二色谱图，该CD谱在240nm有一负峰，265nm处有一正峰，该特征峰为平行G-四链体特征峰，因此T30695特征信号为平行G-四链体；(2)为Z的圆二色谱图，在260nm处有一负峰，295nm处有一正峰，该特征信号为反平行G-四链体；由T30695和Z以3:1比例混合充分孵育后圆二色谱图在240nm有一负峰，265nm有一正峰，为平行G-四链体。图3B可以看出，当AMT加入到0.25uMT30695/Z混合液(duplex)中，圆二色谱信号基本无变化，说明AMT与双链结合荧光猝灭不影响DNA结构，AMT嵌入双链所形成的平行G-4中使得荧光猝灭。图3C中，加入Pb2+离子后240nm负峰逐渐减弱，平行G-四信号减弱，并且同时随着Pb2+浓度增大在295nm有一负峰强度增大，315nm处有一正峰强度增大，该特征信号为铅离子稳定的反平行G-四链体结构特征峰，CD信号由平行G-四转变为Pb2+稳定的反平行G-四，这主要是由于G-四链体与Pb2+结合能力(logK≈7)大大强于G-四链体与AMT结合能力(logK≈5)，使得体系中加入Pb2+后置换出G-四链体-AMT中的AMT，形成G-四链体-Pb2+。同时AMT被释放，体系荧光大大增强，验证了设想。本专利技术基于平行G-四链体诱导AMT荧光猝灭，铅离子与补骨脂素竞争性结合适体，导致由AMT-适体平行G-四链体转变为Pb2+-适体反平行G-四链体从而释放出补骨脂素，构建了一种荧光增强型传感器。本专利技术创新点及优点在于：选择经济、高水溶性和低毒性的荧光指示剂AMT作为指示剂，利用G-四链体的强淬灭能力，开发了一种新型无标记，高选择性，高灵敏度的荧光增强型适体传感器。所开发的适体传感器在10nM～300nM的Pb2+浓度范围内检测具有高选择性和良好的准确度，通过3σ/K公式计算出检测限(LOD)为1.98nM。与其它传感器相比，对Pb2+具有较高选择性。利用适体传感器成功分析了稀释人血清样品中的Pb2+。所开发的适体传感器在实际临床复杂样品中检测Pb2+具有实际应用价值。利用G-四链体的猝灭能力，通过合理的设计可以开发各种新型传感器，拓宽了其应用前景。本专利技术涉及的DNA序列见序列表。附图说明图1为本专利技术基于无标记适体检测Pb2+的原理图；图2为在10mMMES-Tris(pH＝5)的缓冲溶液、4μMAMT中不同适配体时，对Pb2+的荧光传感响应图，适配体浓度均为4μM。图3为10mMMES-Tris(pH＝5)缓冲溶液中，加入Pb2+前后DNA的圆二色(CD)光谱图变化，其中，图A为(1)0.2μMT30695，(2)0.2μMZ，(3)0.2μMT30695+Z；图B为(1)0.2μMT30695+Z；(2)0.2μMT30695/Z+1μMAMT；(3)0.2μMT30695/Z+2μMAMT；(4)0.2μMT30695/Z+4μMAMT；图C为中(1)为0.2μMT30695+Z，(2)为0.2μMT30695/Z+4μMAMT，其他为体系中加入不同浓度的Pb2+，沿左箭头依次为：(3)T30695/Z/AMT+1μMPb2+；(4)T30695/Z/AMT+3μMPb2+；(5)T30695/Z/AMT+5μMPb2+；(6)T30695/Z/AMT+10μMPb2+；(7)T30695/Z/AMT+15μMPb2+；(8)T30695/Z/AMT+20μMPb2+。图4为pH值及缓冲溶液浓度对传感体系的影响，图A为本专利技术体系中(20μMPb2+)，不同pH值条件下测定的荧光增强F/F0变化柱状图；图B为本专利技术体系中(20μMPb2+，pH＝5)，不同浓度的MES-Tris的缓冲溶液中测定的荧光增强F/F0变化曲线。图5为本专利技术传感体系优化条件的选择图，其中A为K+浓度对体系传感性能的影响；B为AMT浓度对体系传感性能的影响；C为T30695与Z两条适配体的比例对体系传感性能的影响；D为T30695与Z两条适配体浓度对体系传感性能的影响。图6为在10mMMES-Tris(pH＝5)的缓冲溶液中，加入不同浓度Pb2+的动力学响应图。图7为本专利技术体传感体系对Pb2+的荧光光谱响应图，内插图：以Pb2+浓度为函数对荧光响应F/F0的关系图。图8为本专利技术体传感体系中F/F0与Pb2+浓度的线性关系图。图9为本专利技术体传感体系中加入Pb2+类似物的荧光响本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光增强型传感器，其特征在于，pH=5.0 的MES-Tris缓冲溶液中，以两条部分互补DNA链T30695、Z混合孵育作为适体，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素（AMT）荧光染料作为传感指示剂构建成传感体系；T30695、Z的DNA碱基序列见序列表中序列1和2。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光增强型传感器，其特征在于，pH=5.0的MES-Tris缓冲溶液中，以两条部分互补DNA链T30695、Z混合孵育作为适体，4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素（AMT）荧光染料作为传感指示剂构建成传感体系；T30695、Z的DNA碱基序列见序列表中序列1和2。


2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿凤华，冯莉，王永祥，王丹丹，徐茂田，瞿鹏，张银堂，
申请(专利权)人：商丘师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41