微孔中通过DNA纳米技术进行单分子检测或定量制造技术

本发明专利技术涉及用于检测靶标结构体的方法和DNA纳米结构体。本发明专利技术具体涉及DNA纳米结构体，其通过巧妙地选择DNA纳米结构体的形状和固定在其上的标记物分子的位置，不依赖于多种这样的DNA纳米结构体的局部排列，确保了对标记物分子的数量和测量信号的优选线性依赖性。本发明专利技术还涉及在用于借助于多重方法优选同时定量多种靶标分子的方法中，使用所述DNA纳米结构体和其他纳米报告子，优选与接头组合以定量，特异性结合于靶标分子。本方法具体涉及单细胞分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微孔中通过DNA纳米技术进行单分子检测或定量本专利技术涉及用于检测靶标结构体的方法和DNA纳米结构体。特别地，本专利技术涉及DNA纳米结构体，其通过巧妙地选择DNA纳米结构体的形状和附着于其上的标记物分子的位置，不依赖于多个这样的DNA纳米结构体的物理排列，确保了标记物分子的数量和测量信号的优选线性依赖性。本专利技术还涉及在用于借助于多重方法(优选同时)定量多个靶标分子的方法中，使用所述DNA纳米结构体和其他纳米报告子，优选与特异性结合靶标分子的接头(衔接头)组合。在研究以及应用医学和生物技术中经常出现的问题是特定靶标结构体的分析，即检测。例如，对于败血症患者，可能需要检测相关毒素，或者，对于需要细胞组成发生改变的疾病，例如患有癌症，可能需要对遗传信息的转换进行定量分析。遗传信息转换的定量分析，即所谓的基因表达图谱(GEP)需要检测和识别许多不同的靶标mRNA分子(Stadler，Z.K.等人CriticalReviewsinOncologyHematology69，1-11(2009))。mRNA是英语术语信使RNA(德语“Boten-RNA”)的既定缩写，也在德语中使用。由于mRNA序列是在相应基因的表达过程中特异性产生的，因此可以以此方式定量分析材料的基因表达。GEP能够提供有关个体细胞或组织样品(多个细胞)的状态或类型的信息，并且从而能够例如进行肿瘤组织的分子诊断。GEP包含至少一种基因表达的分析，优选多种基因表达的分析。为了达到这个最终目的，需要这样的技术：其优选地对尽可能高数量的基因，同时允许定量分析具有尽可能高的特异性和灵敏度。为了在临床实践中全面应用，该技术还必须具有快速分析时间、低成本和易于使用的特点。存在多种GEP技术，它们根据所讨论的问题具有不同的优点和缺点。微阵列.使用微阵列进行的GEP分析基于荧光DNA分子与芯片上特定的物理上分隔的靶标序列的表面杂交(Trevino，V.等人MolMed13，527-541(2007))。这些分子是通过RNA分子的逆转录和聚合酶链反应(PCR)扩增而在先前的步骤中产生的。因此，微阵列允许并行检测最多达数千个序列。但是，精确的定量是不可能的，因为酶促反应(例如逆转录和PCR扩增)会导致系统错误。而且，基于微阵列的方法需要相对较长的处理时间，约一天，因此不适用于大量的临床应用。qPCR/dPCR.使用PCR，可以在酶促过程中以指数方式复制特定的DNA分子(VanGuilder，H.D.等人Biotechniques44，619-626(2008))。对于PCR反应，mRNA靶标通常必须使用RNA的逆转录酶促转化成DNA。通过添加荧光DNA结合分子可以对扩增进行测量，并可以粗略确定原始浓度(qPCR)。由于扩增速率很大程度上取决于各种参数(尤其是靶标序列、靶标长度、引物、仪器、试剂、反应体积)，因此必须对所述定量进行精确校准。为了弥补这些缺点，开发了数字PCR(dPCR)。它允许通过分隔各个靶标分子来实现更精确的定量(Baker，M.NatureMethods9，541-544(2012))。然而，所述dPCR的高精度由于限于通常两个靶标而被抵消。因此，dPCR不适合于GEP分析。RNA-Seq/NGS.借助所谓的下一代测序(NGS)，RNA测序(RNAseq)也基于此，每个碱基可以以数个步骤读出并识别序列(Wang，Z.等人NatRevGenet10，57-63(2009))。对于RNA测序，也必须首先将RNA酶促转化为DNA。NGS在转录分析中的优势和独特之处是可以识别新的或改变的序列。由于大量复杂的处理步骤，因此分析设备复杂且昂贵，并且处理时间长。这使其不能用于保健领域。就像上述方法一样，酶促过程会阻止精确的可定量性。nCounter.NanoStringTechnologies的nCounter系统基于，一方面使用荧光报告子(条形码)，另一方面使用用于附着至显微芯片的第二DNA分子(捕获链)，通过杂交检测RNA分子(Geiss，G.K.等人NatBiotechnol26，317-325(2008))。荧光报告子是线性几何条形码，其长度为微米级并且由荧光染料标记的不同区域的布置组成。nCounter系统的优势之一是无酶且定量检测最多达800个不同的RNA靶标分子。该方法的缺点之一是必须在靶标杂交和表面固定后拉伸几何条形码分子，以便能够读取相应的条形码。这有两个重要的含义：(1)报告子的电泳拉伸是复杂的处理步骤，(2)由于该步骤效率低，约80％的靶标分子由于条形码无法识别而被排除在外。此外，必须进行复杂且耗时的纯化步骤，例如使用磁性颗粒。总之，这些工艺步骤导致昂贵的分析装置(>200,000欧元)和较长的测量时间(24-48小时)。因此，这些传统方法不能满足所有对GEP的上述优选要求，并为了必要的灵敏度而牺牲了例如部分可定量性。GEP的其他有前途的分析方法是基于通过使用荧光报告子的所谓杂交直接标记单个靶标mRNA序列。荧光方法允许灵敏地检测单个分子(Joo，C.等人AnnuRevBiochem77，51-76(2008))。但是，已建立的方法无法确定大量不同的报告子。采用可用的方法在单细胞基础上进行定量GEP仅在有限的方式中可行，但对于科学研究和工业研发以及临床应用都将是非常有利的。GEP的重要所需特征是精确定量和有效实施分析。这产生了改善GEP的以下优选标准：·直接检测mRNA，特别是不翻译成DNA，例如通过逆转录·没有扩增靶标分子，因为不精确的扩增会影响定量·由此：检测单个靶标分子·尽可能快的分析(几分钟)·尽可能简单的分析，尤其是：工作步骤少·分析结果与样品原始成分相关的可能性除核酸和蛋白质外，还有许多其他问题，必须检测几纳米到几十纳米数量级的单位并优选计数和/或确定其浓度；例如无机复合物和纳米颗粒。所有这些问题的共同点是，应以快速、简单和准确的方式检测分子或其他结构体并优选对其进行计数。精确计数尤其必须使假阳性和/或假阴性计数事件的概率保持尽可能低。本专利技术旨在改善所述特性中的一个或多个，特别是降低假阳性和/或假阴性计数事件的可能性。该问题通过如独立权利要求所述的本专利技术解决。由于多个方面与现有技术相比有利，所以本专利技术允许解决前述问题。本专利技术涉及这样的方法：该方法允许对单个细胞或其他结构体在此规模或相似规模下分析。在这方面具有特别有利效果的方法的一个方面是要在微孔中分析的结构体的分离。这样允许减少实际要单独分析的结构体的由于扩散损失、外部输入和/或混合而导致的结果失真。微孔的使用还具有下述优点：可以将错误加载的微孔快速且简单地丢弃，从而导致提高了分析结果的准确性。根据本专利技术的另一个方面，尽管对要分析的结构体进行单独的分析，也可以对多个要分析的结构体并行分析。与开始时提到的已知方法相比，该方法只涉及少量步骤，从而降低了由分析工艺本身造成伪影形成的风险。分离待分析结构体的方法的步骤有利地保持简单，这与其他分离技术(例如分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测靶标结构体的方法，包括：/np1)将包括具有靶标结构体的宿主体的一组宿主体引入微孔阵列中，使得恰好一个宿主体存在于至少一个微孔中；/np2)将至少两种3D DNA纳米结构体引入所述至少一个微孔中，其中每种所述3D DNA纳米结构体包含一种或多种向内布置的荧光染料分子；/na)在所述至少一个微孔中形成识别结构体，包括：/n(i)所述靶标结构体，和/n(ii)所述至少两种3D DNA纳米结构体，其中每种所述3D DNA纳米结构体特异性结合于所述靶标结构体，并且其中所述3D DNA纳米结构体结合于所述靶标结构体的成对的不同区域；/nb)通过测量至少一种荧光信号检测所述靶标结构体，/n其中，选择所述3D DNA纳米结构体和荧光测量的参数，使得a)中形成的所述识别结构体的至少一种测量的荧光信号与至少两种分离的3D DNA纳米结构体在它们未结合于相应的识别结构体中时的每一种的所述荧光信号可区分，其中所述识别结构体结合于第一表面，优选所述至少一个微孔的底部。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171214 EP 17207476.71.一种检测靶标结构体的方法，包括：
p1)将包括具有靶标结构体的宿主体的一组宿主体引入微孔阵列中，使得恰好一个宿主体存在于至少一个微孔中；
p2)将至少两种3DDNA纳米结构体引入所述至少一个微孔中，其中每种所述3DDNA纳米结构体包含一种或多种向内布置的荧光染料分子；
a)在所述至少一个微孔中形成识别结构体，包括：
(i)所述靶标结构体，和
(ii)所述至少两种3DDNA纳米结构体，其中每种所述3DDNA纳米结构体特异性结合于所述靶标结构体，并且其中所述3DDNA纳米结构体结合于所述靶标结构体的成对的不同区域；
b)通过测量至少一种荧光信号检测所述靶标结构体，
其中，选择所述3DDNA纳米结构体和荧光测量的参数，使得a)中形成的所述识别结构体的至少一种测量的荧光信号与至少两种分离的3DDNA纳米结构体在它们未结合于相应的识别结构体中时的每一种的所述荧光信号可区分，其中所述识别结构体结合于第一表面，优选所述至少一个微孔的底部。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述宿主体是细胞、病毒、外体、囊泡和/或液滴。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述靶标结构体存在于宿主体中，其中所述方法还包括：
c)破坏所述宿主体，优选通过用破坏缓冲液进行液体交换，从而将所述靶标结构体从所述宿主体中释放。


4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述靶标结构体包含或者是多核苷酸，优选部分单链的多核苷酸，优选单链的多核苷酸，并且特别优选mRNA。


5.一种用于荧光显微术的微孔阵列，其包括多个微孔，其中，每个微孔包括底部和周壁，其中所述底部适合于荧光显微术，并且其中每个所述微孔具有优选开口的顶侧，
其中，所述微孔阵列还包括：
第一层，其形成所述微孔的所述底部，其中所述第一层适合于荧光显微术并且优选是盖玻片；
第二层，其施加在所述第一层上，其中所述第二层形成所述微孔的所述壁。


6.如权利要求5所述的微孔阵列，其中，一种或多种载体接头结合于至少一个所述微孔的所述底部。


7.如权利要求5至6中任一项所述的微孔阵列，其中，所述第二层包含SU-8，优选PEG-DA，特别优选PDMS，更优选CYTOP，并且特别优选液体玻璃和/或由其组成。


8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列是权利要求5至7中任一项所述的微孔阵列，并且其中所述第一表面是所述至少一个微孔的所述底部，其中优选所述靶标结构体通过与所述靶标结构体特异性结合的载体接头的介导结合于和/或将结合于所述微孔的所述底部。


9.如权利要求8所述的方法，还包括：
f)通过将油层施加于所述第二层来封闭所述微孔阵列的所述顶侧；
其中，油可选地包含脂质并且所述方法可选地还包括：

【专利技术属性】
技术研发人员：海因里希·格拉布迈尔，约翰内斯·贝内迪克特·韦尔施泰因，
申请(专利权)人：慕尼黑路德维希马克西米利安斯大学，
类型：发明
国别省市：德国;DE