一种测定人血清Hg制造技术

本发明专利技术属于化学分析与检测技术领域，涉及一种人血清Hg

【技术实现步骤摘要】
一种测定人血清Hg2+含量的荧光传感器
本专利技术属于化学分析与检测
，涉及一种人血清Hg2+荧光分析法，尤其涉及一种基于无标记核酸适体的人血清Hg2+荧光传感器。
技术介绍
汞导致人类认知和神经肌肉损害，已经成为引起关注的重要的全球有毒污染物之一，汞在环境中无处不在，可以在空中、水中传播，也可以吸附到土壤、雪、冰和沉积物中影响大气环境。并且汞可以穿透血脑屏障和胎盘屏障，极大影响利神经肌肉和发育健康。汞主要通过自然和人为过程进入环境，气态单质汞通过化学转化后具有更高水溶性，通过气态氧化汞和微粒结合型汞沉积到陆地和水生环境中。水生微生物将气态氧化汞转化为具有神经毒性的有机甲基汞物中，其浓度可在肌肉组织中生物累积，在高阶鱼类中可增加至百万倍。因此，快速、灵敏地检测汞离子已成为一个非常重要的任务。关于检测Hg2+前人开发了许多关于汞的检测方法。包括比色法、原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)、X射线吸收光谱法(XAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)。但这些方法存在使用材料成本高、检测程序复杂、仪器昂贵以及不能够快速进行分析检测等不足，使得其不便应用于实际样品的便捷快速检测，因此，开发经济实用型的Hg2+传感器十分必要。2004年Akira等人开发了一种基于寡脱氧核糖核苷酸(ODN)的荧光分析传感系统，用于选择性检测水溶液中的Hg2+离子。提出了Hg2+与DNA双链体中的胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(T-T)碱基对的选择性结合。由于T-T与汞的结合牢固且具有高选择性，因此在Hg2+存在的情况下，包含T-T碱基对的双链适体可以形成T-Hg2+-T稳定状态，并且其他重金属离子对双链体稳定性没有任何显著影响。因此，开发出一种依赖于Hg2+离子与T-T碱基对的选择性结合应用于Hg2+高选择性检测的传感器是可行的。该荧光分析法具有便捷快速、灵敏度高、快速检测等优点，但在整个传感过程对Hg2+的响应依靠形成T-Hg2+-T结构的同时猝灭剂结合荧光剂使得传感体系荧光猝灭，这种荧光猝灭型传感器由于背景荧光过高影响了传感器的传感效率。目前还需要对此类传感器进行改进。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种无标记核酸适配体荧光增强型传感器，应用于Hg2+的检测，减少背景荧光的干扰，提高传感效率。4'-氨基甲基-4,5',8-三甲基补骨脂素(4'-aminomethyl-4,5',8-trioxalen，AMT)是一种清洁、高水溶性荧光染料，由于其自身具有强荧光在与G-四链体结合后荧光极大猝灭可以应用于构建基于核酸适配体的荧光传感器中。为实现本专利技术目的，本专利技术利用含有T碱基且能够折叠成G-四链体的富G核酸适体DNA，以AMT作为荧光读数指示剂，共同构建无标记核酸适配体荧光增强型传感器，应用于Hg2+的检测。所述无标记核酸适配体荧光增强型传感器具体通过如下方法构建而成：在5mMpH＝7.2Tris-HCl(含10mMK+)缓冲溶液中，加入AMT，AGRO100适配体DNA(5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’)混合均匀。所述AMT在缓冲溶液中的浓度为3μM，所述AGRO100适配体在缓冲溶液中的浓度为5μM；所述AGRO100适配体DNA序列为序列表中序列1。检测Hg2+时取构建好的传感器体系溶液加入待测液中，充分混匀后室温下测定其荧光发射光谱。荧光发射波长为360nm至660nm，激发波长为340nm。根据标准工作曲线实现人血清中Hg2+的定性或定量检测。本专利技术原理：该传感体系利用适配体与荧光染料AMT相互作用，从而改变AMT荧光强度，构建荧光指示传感检测Hg2+。传感体系原理如图1所示，富G且包含T碱基的DNA适配体序列AGRO100在含有K+离子的缓冲溶液中能够折叠形成平行G-四链体。AMT荧光染料自身在缓冲溶液中具有强荧光，当G-四链体存在时，AMT能够与G-四链体结合，导致荧光猝灭。然而当Hg2+存在时，Hg2+与DNA序列中的T碱基特异性结合形成T-Hg2+-T结构。从而阻碍了AGRO100折叠形成G-四链体，因此在含有Hg2+时体系中G-四链体被破坏，再向其中加入AMT荧光染料不能充分与G-四链体结合，AMT荧光猝灭能力减弱，当体系中Hg2+浓度越大，适配体AGRO100猝灭荧光染料AMT能力越弱，传感体系荧光越强，以此原理构建无标记适配体传感器检测Hg2+。本专利技术优点：选择在含有K+的缓冲溶液中能够折叠形成G-四链体的核酸适体(AGRO100)作为适配体，与自身具有强荧光的AMT结合，共同构建荧光增强型传感器，Hg2+的量与体系荧光增强程度呈现比例，荧光增强型适体传感器大大降低了传统荧光传感器的背景荧光，可以应用于人血清中Hg2+的定性或定量检测。此传感器检测Hg2+灵敏度高，检测下线为0.163μM。将其应用于人血清样品中Hg2+分析，具有实际应用价值。本专利技术涉及的核苷酸序列见序列表。附图说明图1为本专利技术传感器工作原理示意图。图2为圆二色(CD)光谱图，其中，A图为加入AMT前后AGRO100圆二色谱信号对比图，在5mMTris-HCl(pH＝7.2,10mMK+)缓冲溶液中3μMAGRO100中加入(a)0μMAMT，(b)0.5μMAMT，(c)1μMAMT，(d)2μMAMT；B图为加入Hg2+前后AGRO100圆二色谱信号对比图，在3μMAGRO100中加入(a)0μMHg2+(b)5μMHg2+；(c)10μMHg2+；(d)20μMHg2+；(e)30μMHg2+；(f)40μMHg2+；(g)60μMHg2+；(C)为AGRO100和Hg2+溶液中加入AMT前后圆二色谱信号对比图，在3μMAGRO100,5μMHg2+中加入(a)0μMAMT，(b)0.5μMAMT，(c)1μMAMT，(d)2μMAMT。图3为在5mMTris-HCl(pH＝7.2,10mMK+)的缓冲溶液中不同适配体传感体系对Hg2+的荧光传感响应，适配体浓度均为5μM，F与F0分别为Hg2+存在与不存在时的最大荧光强度；图4为传感体系pH及缓冲溶液条件优化，其中，图A为在5mMTris-HCl，10mMK+的缓冲溶液中pH对传感体系影响，B为在不同浓度的Tris-HCl(pH＝7.2,10mMK+)的缓冲溶液中传感体系对Hg2+响应。图5为在5mMTris-HCl(pH＝7.2)的缓冲溶液中传感体系中K+浓度的优化。图6为在5mMTris-HCl(pH＝7.2,10mMK+)的缓冲溶液中适配体及指示剂浓度优化，其中，图A为传感体系中AMT浓度的优化；图B为传感体系中DNA(AGRO100)浓度的优化。图7为本专利技术传感体系对Hg2+的荧光光谱响应图，其中A图从下至上Hg2+浓度依次为0μM、3μM、7μM、12μM、20μM、25μM、30μM、35μM、45μM、50μM、60μM、80μM、100μM。内插图：以Hg2+浓度为函数对荧光响应F/F0的关系图。B为F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定人血清Hg

【技术特征摘要】
1.一种测定人血清Hg2+含量的荧光传感器，其特征在于，具体通过如下方法构建而成：在5mMpH=7.2Tris-HCl缓冲溶液中，加入AMT，AGRO100适配体DNA混合均匀；所述AMT在缓冲溶液中的浓度为3µM，所述AGRO100适配体在缓冲溶液中的浓度为5µM；所述AGRO100适配体DNA序列为序列表中序列1；所述缓冲溶液中含1...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿凤华，冯莉，王丹丹，徐茂田，瞿鹏，张银堂，
申请(专利权)人：商丘师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41