用于检测靶蛋白的非抗体配体制造技术

本发明专利技术总体上涉及在包含靶杀昆虫蛋白和非靶杀昆虫蛋白的复合生物基质中示差检测或定量所述靶蛋白的合成非抗体蛋白支架(synNAPS)，并且涉及在免疫测定中使用synNAPS的方法，并且更具体地涉及用于在复合生物样品中示差检测和定量来自苏云金芽孢杆菌的野生型晶体蛋白如野生型Cry1Ab、和杂合晶体蛋白的单克隆抗体和免疫测定，所述杂合晶体蛋白包含全部或很大一部分野生型Cry蛋白，所述复合生物样品包含野生型Cry蛋白和一种或多种杂合Cry蛋白两者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测靶蛋白的非抗体配体
本专利技术涉及特异性结合杀昆虫蛋白并且可用于复合混合物中目的靶蛋白的示差检测或定量的合成非抗体蛋白支架。本专利技术进一步总体上涉及用于在生物样品(例如含有靶蛋白和非靶蛋白的复合混合物的转基因植物样品)中可靠地确定某些目的靶蛋白的存在和量的诊断方法，并且涉及为所述诊断方法提供基本试剂的测试试剂盒。
技术介绍
转基因作物由越来越复杂的遗传修饰(包括赋予不同性状的多个转基因，也称为“基因堆叠”或“性状堆叠”)组成。例如，目前市场上的许多转基因玉米产品在同一植物内含有用于控制广谱昆虫有害生物的多种杀昆虫蛋白和赋予植物对广谱化学除草剂的耐受性的多种蛋白。许多用于控制昆虫有害生物的转基因蛋白(例如来自苏云金芽孢杆菌的晶体内毒素(称为Cry蛋白))可以彼此结构上密切相关并且具有相似的总体氨基酸序列同一性或含有具有显著同一性的基序或结构域。一般而言，Cry蛋白例如具有三个结构性结构域：N-末端结构域I，从残基1至约290，由7个α螺旋组成；结构域II，从约残基291-500，含有三个β片层；以及C-末端结构域III，从约残基501-644，为β夹层(beta-sandwich)。大多数针对鳞翅目或鞘翅目昆虫有活性的Cry蛋白在结晶基体中分别形成为130-140kDa或60-70kDa的原毒素。在鳞翅目昆虫中，肠的碱性pH溶解这种晶体并且然后肠蛋白酶将130-140kDa的原毒素加工成大约60-70kDa的毒蛋白。在鞘翅目昆虫中，60-70kDa的原毒素被加工成55-67kDa的毒素。鳞翅目活性Cry蛋白的实例包括Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F和Cry9。鞘翅目活性Cry蛋白的实例包括Cry3A、Cry3B、Cry3C、Cry8、二元Cry23-Cry37以及二元Cry34-Cry35。已报道将Cry蛋白原毒素蛋白水解加工成杀昆虫毒素是通过去除N-末端和C-末端的氨基酸而进行的，其中进行加工的确切部位取决于特异性Cry蛋白以及所涉及的特异性昆虫肠液(Ogiwara等人,1992,J.Invert.Pathol.[无脊椎动物病理学杂志]60:121-126)。Gry原毒素的这种蛋白水解激活在确定其特异性方面能够发挥重要作用。文献中已经披露了许多成功的创造杂合Cry蛋白的尝试。例如，将来自Cry1Aa蛋白的蚕蛾(家蚕(Bombyxmori))特异性结构域移动至Cry1Ac蛋白，由此将一种新的杀昆虫活性赋予生成的Cry1Aa-Cry1Ac嵌合蛋白(Ge等人1989,PNAS[美国科学院院刊]86:40374041)。Thompson等人，1996和1997(美国专利5,527,883和5,593,881)用Cry1Ab蛋白的原毒素尾区替换野生型Cry1F蛋白和Cry1C蛋白的原毒素尾区以制造Cry1F-Cry1Ab杂合Cry蛋白和Cry1C-Cry1Ab杂合Cry蛋白，它们在某些表达宿主细胞中都具有改进的表达。Bosch等人，1998(美国专利5,736,131)通过如下创造了新的鳞翅目活性蛋白：用Cry1Ca蛋白的结构域III取代Cry1Ea蛋白和Cry1Ab蛋白的结构域III，从而产生称为G27的Cry1E-Cry1C杂合Cry蛋白和称为H04的Cry1Ab-Cry1C杂合Cry蛋白，它们都具有比野生型Cry蛋白亲本分子更宽的鳞翅目活性谱。Malvar等人，2001(美国专利6,242,241)将Cry1Ac蛋白的结构域I与Cry1F蛋白的结构域II和III以及原毒素尾部进行结合以产生比母体野生型Cry蛋白具有更广杀昆虫活性的Cry1Ac-Cry1F杂合Cry蛋白。Bogdanova等人，2011(美国专利8,034,997)将Cry1Ab蛋白的结构域I和II与Cry1Fa蛋白的结构域III结合，并添加Cry1Ac蛋白原毒素尾部以产生称为Cry1A.105的新的鳞翅目活性杂合Cry蛋白。而且，Hart等人，2012(美国专利8,309,516)将修饰的Cry3A蛋白的结构域I和II与Cry1Ab蛋白的结构域III结合，并添加Cry1Ab蛋白原毒素尾部的一部分以产生称为FR8a的鞘翅目活性杂合Cry蛋白(也称为eCry3.1Ab)。迄今为止报道的大多数杂合Cry蛋白已经使用了全部或部分相同类型的野生型Cry蛋白，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F和Cry3A。若干野生型Cry蛋白，例如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry1F、Cry2A、Cry2Ba、Cry3A、Cry3B、Cry9C和Cry34-Cry35，以及营养期杀昆虫蛋白，例如Vip3A(参见美国专利5,877,012)，已经在转基因作物植物中表达，包括玉米、棉花、稻和大豆，早自1996年以来，其中一些已经在商业上被用于控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。最近，已经在商业上引入了转基因作物产品，例如玉米，所述转基因作物产品含有其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入的工程化的Cry蛋白(例如，修饰的Cry3A(mCry3A；US专利7,230,167))和杂合Cry蛋白(例如上述eCry3.1Ab和Cry1A.105)。重组DNA技术越来越多地用于产生商业和工业用途的转基因植物，这需要开发分析转基因植物系的诊断方法。需要此类方法来通过连续世代的育种维持转基因植物品种，监测环境中或源自转基因植物的生物样品中的转基因植物或植物部分的存在，以及协助快速产生并且开发具有期望的或最佳的表型的新转基因植物。此外，目前许多国家的监管机构关于转基因植物的安全性评估指导原则需要在DNA和蛋白水平的表征，从而获得并且维持监管批准。堆叠到如上所述的转基因植物中的基因和蛋白越来越复杂，使得在复合混合物内检测和定量任何一种靶蛋白的特异性变得困难，特别是在堆叠的转基因蛋白彼此相似、或与环境中的野生型非转基因蛋白相似、或与相对于转基因植物而言内源的非转基因蛋白相似的情况下。免疫测定是目前农业产业中用于检测和定量通过植物遗传修饰而引入的蛋白的优选方法。免疫测定的关键部分是对靶蛋白(抗原)具有特异性的抗体。免疫测定可以是高度特异性的，并且样品在被分析前通常只需要一个简单的准备。此外，免疫测定可以在很宽的浓度范围内定性或定量地使用。典型地，免疫测定需要针对每种目的蛋白进行单独的测试。抗体可以是在动物中产生的多克隆的或者是由细胞培养物产生的单克隆的抗体。就其性质而言，多克隆抗体的混合物将具有多个识别表位，所述识别表位可以增加敏感性，但是也可能降低特异性，因为序列和结构与其他蛋白具有同源性的可能性随着不同抗体互补位的存在数量而增加。单克隆抗体比多克隆抗体具有一些优点，因为它们对单个表位或抗原决定簇表达均匀的亲和力和特异性，并且可以大量生产。然而，所有抗体中存在固有特性限制其在更高要求的应用(例如复合混合物中的单个转基因蛋白、或相似的转基因蛋白或内源蛋白的示差检测和定量)中的使用。此外，多克隆抗体和单克隆抗体都可能需要进一步纯化步骤来增强灵敏度并降低测定中的背景。由于它们对在某些条件下的使用具有限制，使用进化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成非抗体蛋白支架(synNAPS)或其抗原结合片段，所述合成非抗体蛋白支架或其抗原结合片段结合杀昆虫蛋白并且任选地包含氨基酸标签。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171215 US 62/599,2891.一种合成非抗体蛋白支架(synNAPS)或其抗原结合片段，所述合成非抗体蛋白支架或其抗原结合片段结合杀昆虫蛋白并且任选地包含氨基酸标签。


2.如权利要求1所述的synNAPS，其中所述杀昆虫蛋白包含SEQIDNO:1-7中任一项的氨基酸序列或SEQIDNO:1-7中任一项的配体结合片段。


3.如权利要求2所述的synNAPS，其中所述synNAPS包含SEQIDNO:10-17、19、21、24-31、33或35中的任一项。


4.如权利要求1所述的synNAPS，其中所述synNAPS包含与SEQIDNO:10、SEQIDNO:17或SEQIDNO:21具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中(a)与SEQIDNO:10具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于SEQIDNO:10的位置22的位置处或在SEQIDNO:10的位置22处具有W、在对应于SEQIDNO:10的位置29的位置处或在SEQIDNO:10的位置29处具有S、在对应于SEQIDNO:10的位置31的位置处或在SEQIDNO:10的位置31处具有Y、和在对应于SEQIDNO:10的位置44的位置处或在SEQIDNO:10的位置44处具有R；或(b)与SEQIDNO:17具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于SEQIDNO:17的位置29的位置处或在SEQIDNO:17的位置29处具有I、和在对应于SEQIDNO:17的位置42的位置处或在SEQIDNO:17的位置42处具有F；或(c)与SEQIDNO:21具有至少80％到至少99％序列同一性的所述氨基酸序列在对应于SEQIDNO:21的位置22的位置处或在SEQIDNO:21的位置22处具有H、在对应于SEQIDNO:21的位置31的位置处或在SEQIDNO:21的位置31处具有R、在对应于SEQIDNO:21的位置40的位置处或在SEQIDNO:21的位置40处具有L、和在对应于SEQIDNO:21的位置44的位置处或在SEQIDNO:21的位置44处具有Y。


5.如权利要求4所述的synNAPS，其中所述synNAPS包含SEQIDNO:56-59、61-63、66、67、69-75、77-79、81-86、88-90、92或95中的任一项。


6.如权利要求1至5中任一项所述的synNAPS，其中当靶转基因杀昆虫蛋白处于一种或多种非靶转基因杀昆虫蛋白存在下时，所述synNAPS对所述靶蛋白具有示差结合亲和力。


7.如权利要求6所述的synNAPS，其中(a)所述靶蛋白是Cry1A蛋白、mCry3A蛋白、eCry3.1Ab蛋白或包含Cry1Ab蛋白的结构域I和结构域II的杂合Cry蛋白，或(b)所述一种或多种非靶蛋白是Cry1A蛋白、Cry1B蛋白、Cry1F蛋白、Cry1I蛋白、Cry1J蛋白、包含Cry1Ab蛋白的结构域I和结构域II的杂合Cry蛋白、包含Cry1F蛋白的结构域III的杂合Cry蛋白、修饰的Cry3A蛋白、包含Cry1Ab蛋白的结构域III的杂合Cry3蛋白、或Vip3蛋白；或(c)(a)和(b)两者。


8.如权利要求7所述的synNAPS，其中靶Cry1A蛋白是Cry1Ab蛋白、Cry1Aa蛋白、Cry1Ai蛋白，或靶杂合Cry蛋白是Cry1Ab.1Ca蛋白或Cry1A.105蛋白。


9.如权利要求8所述的synNAPS，其中a)所述靶蛋白是Cry1Ab并且所述非靶蛋白包括mCry3A和eCry3.1Ab；或b)所述靶蛋白是mCry3A并且所述非靶蛋白包括Cry1Ab和eCry3.1Ab；或c)所述靶蛋白是eCry3.1Ab并且所述非靶蛋白包括Cry1Ab和mCry3A；或d)所述靶蛋白是Cry1Ab或Cry1Ab.1Ca并且所述非靶蛋白包括Cry1Aa或Cry1Ai；或e)所述靶蛋白是Cry1Ab或Cry1Ai蛋白并且所述非靶蛋白包括Cry1Aa或Cry1Ab.1C；或f)所述靶蛋白是Cry1Ab、Cry1Ai或Cry1Ab.Cry1C蛋白并且所述非靶蛋白是Cry1Aa；或g)所述靶蛋白是Cry1Ab蛋白或Cry1Ab.Cry1C蛋白并且所述非靶蛋白包括Cry1Aa或Cry1Ai蛋白；或h)所述靶蛋白是Cry1Aa或Cry1Ai蛋白并且所述非靶蛋白包括Cry1Ab蛋白或Cry1Ab.1Ca蛋白。


10.如权利要求9所述的synNAPS，其中所述Cry1Ab蛋白具有包含SEQIDNO:1的氨基酸序列，所述mCry3A蛋白具有包含SEQIDNO:2的氨基酸序列，所述eCry3.1Ab蛋白具有包含SEQIDNO:3的氨基酸序列，所述Cry1Aa蛋白具有包含SEQIDNO:4的氨基酸序列，所述Cry1Ai蛋白具有包含SEQIDNO:5的氨基酸序列，所述Cry1Ab.1Ca蛋白具有包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或Cry1A.105蛋白具有包含SEQIDNO:7的氨基酸序列。


11.如权利要求10所述的synNAPS，其中在mCry3A和eCry3.1Ab存在下对所述Cry1Ab蛋白具有示差结合亲和力的synNAPS包含SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12。


12.如权利要求10所述的synNAPS，其中在Cry1Ab和eCry3.1Ab存在下对所述mCry3A蛋白具有示差结合亲和力的synNAPS包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16。


13.如权利要求10所述的synNAPS，其中在Cry1Ab和mCry3A存在下对所述eCry3.1Ab蛋白具有示差结合亲和力的synNAPS包含SEQIDNO:20。


14.如权利要求6所述的synNAPS，其中复合生物基质源自转基因植物或转基因微生物。


15.如权利要求14所述的synNAPS，其中(a)所述转基因植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、棉花、低芥酸菜籽、小麦和稻；或(b)所述转基因微生物是选自由以下组成的组的转基因细菌：大肠杆菌、假单胞菌属物种或芽孢杆菌属物种。


16.一种如权利要求1至5中任一项所述的synNAPS的抗原结合片段。


17.权利要求16所述的抗原结合片段，其中所述片段包含SEQIDNO:9-36中任一项的至少约14个到至少约65个氨基酸。


18.权利要求17所述的抗原结合片段，其中所述片段包含SEQIDNO:40-53中的任一项。


19.一种核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1至5中任一项所述的synNAPS或其抗原结合片段。


20.一种转基因生物，所述转基因生物包含如权利要求19所述的核酸分子。


21.如权利要求20所述的转基因生物，所述转基因生物是转基因细菌或转基因植物。


22.如权利要求21所述的转基因生物，其中(a)所述转基因植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、棉花、低芥酸菜籽、小麦和稻；或(b)所述转基因细菌选自由以下组成的组：大肠杆菌、假单胞菌属物种和芽孢杆菌属物种。


23.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至5中任一项所述的第一synNAPS和第二配体，其中所述synNAPS和所述第二配体在包含靶蛋白和非靶蛋白的生物样品的免疫测定中共同起作用，以示差检测或定量所述靶蛋白，其中所述非靶蛋白至少具有连续27％的所述靶蛋白的氨基酸序列。


24.如权利要求23所述的组合物，其中所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫色谱法或免疫定位。


25.如权利要求24所述的组合物，其中所述第二配体是抗体或不同于所述第一synNAPS的第二synNAPS。


26.如权利要求25所述的组合物，其中将所述第一synNAPS用作涂覆配体，并且将所述第二配体用作检测配体。


27.如权利要求25所述的组合物，其中所述生物样品是转基因植物样品。


28.如权利要求27所述的组合物，其中所述转基因植物是转基因玉米植物。


29.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·S·亚内尔，S·扬，O·基腾，A·谢弗雷尔，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH