一种外周血中的肿瘤细胞株数量的检测方法技术

本发明专利技术为肿瘤细胞检测提供一个可靠的内控质量控制方法，在精确的知道检测技术上限的同时准确的计算出细胞的回收率而得出整体循环肿瘤细胞的数目，极大的提升检测的可信度。本发明专利技术所述的方法，包括以下步骤：1)外周血样本的获得，2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠，3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集，4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血中的肿瘤细胞株数量的检测方法
：本专利技术涉及一种外周血中的肿瘤细胞株数量的检测方法。
技术介绍
：日常如果发现患有肿瘤的症状时，需及早诊断，及时治疗；早诊断的方法包括，检测外周血中的肿瘤细胞株数量。现有技术公开了外周血中的肿瘤细胞富集方法，如：PeterPingLin,OlivierGires,DaisyDandanWang,LindaLi&HongxiaWang(2017)Comprehensiveinsituco-detectionofaneuploidcirculatingendothelialandtumorcells.SciRep7:9789□文献，公开了如何全面的检测到循环肿瘤细胞和异倍体上皮细胞。P.Lin(2015)IntegratedEpCAM-independentsubtractionenrichmentandiFISHstrategiestodetectandclassifydisseminatedandcirculatingtumorscells.ClinTranslMed4(38):1-7□文献。公开了如何利用非EpCAM依赖性的负向方法检测及归类循环肿瘤细胞。Q.Chen,F.Ge,W.Cui,F.Wang,Z.Yang,Y.Guo,L.Li,R.Bremner,andP.Lin(2013)LungCancerCirculatingTumorCellsIsolatedbytheEpCAM-IndependentEnrichmentStrategyCorrelatewithCytokeratin19-DerivedCYFRA21-1andPathologicalStaging.ClinChimActa419:57-61□文献，公开了使用非EpCAM依赖性方法富集及检测肺癌循环肿瘤细胞。但现有技术的缺陷在于，没法知道捕获到的细胞占整体肿瘤细胞总数的比例和准确数目，无法定量。目前需要提供定量数据，并制定一种捕获到的肿瘤细胞占整体肿瘤细胞总数的比例的标准，根据该标准，判断肿瘤细胞的发生，发展，治疗效果等，可用于肿瘤的检测，排除假阳性，判断药物的治疗效果。
技术实现思路
：本专利技术为肿瘤细胞检测提供一个可靠的内控质量控制方法，在精确的知道检测技术上限的同时准确的计算出细胞的回收率而得出整体循环肿瘤细胞的数目，极大的提升检测的可信度。本专利技术的检测方法，步骤如下：同时加入已知数目的细胞株及仿真人工合成荧光圆珠，完成整个富集流程后，在显微镜下辨认及计数余下的细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。经过多次实验证实荧光珠与细胞株的富集率高度一致并可以替代细胞株作为检测的可靠质量内控。本专利技术所述的检测方法，包括以下步骤：1)外周血样本的获得採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血。首先消毒，左手拇指固定穿刺血管下端，右手拇指和中指持负压采血针，食指固定针头下座，使针头斜面和刻度朝上，以30度角方向沿静脉方向刺入皮肤，然后以5度角方向进入血管，见回血后在蝴蝶针的另一端插入真空採血管，让负压抽取6mL血。2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)。离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞。4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。以下为本专利技术名词术语的解释：循环肿瘤细胞，定义如下：循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTC)是指进入到血液循环中的肿瘤细胞。部分CTC可以逃离机体免疫识别或药物治疗，在体内寻找合适的微环境，形成“种子”在远端组织器官或原发组织种植生长，造成肿瘤的转移或复发。外周血，定义如下：外周血是除骨髓之外的血液人工合成的仿细胞荧光圆珠，定义如下：荧光染料混合在珠子上的聚苯乙烯荧光微球，密度为1.095—1.120g/cm～3，与淋巴细胞及单核白细胞密度一样，可广泛应用于血流测定、示踪、体内成像、影像校准和流式细胞仪等。循环肿瘤细胞的富集，定义如下：从全血样本中分离出外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell，PBMC)，再通过偶联了抗人CD45单克隆抗体的免疫磁珠去除肿瘤病人PBMC细胞中的CD45+细胞，从而有效的富集了病人外周血标本的循环肿瘤细胞(CTCs)。肿瘤细胞及荧光圆珠的辨认及计数，定义如下：肿瘤细胞的辨认是通过免疫荧光细胞化学通过PE标记的抗人CD45抗体(PE-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，加上CEP8荧光探针对染色体线粒体的原位杂交，CD45表达阴性(DAPI+/CD45-/CEP8异倍体)的细胞被鉴定为CTC。荧光圆珠是通过绿色荧光和大小15微米的圆体鉴定而来。细胞株及荧光圆珠的富集率计算公式，定义如下：细胞株富集率＝最后鉴别到的细胞株/已知加入健康人血的细胞株数目。荧光圆珠富集率＝最后显微镜鉴别到的荧光珠数目/已知加入健康人血的荧光圆珠。本专利技术的方法，是经过以下实验后经过筛选获得的，实验如下:加入已知数目的细胞株到抽取健康人的6mL血液里模拟肿瘤细胞的真实环境，完成整个富集流程，在显微镜下辨认并计数余下细胞株，得取实验的细胞富集率，从而推算出真实的肿瘤细胞富集率。以下为该实验的详细描述：一、实验目的在6mL血液里加入已知数目的细胞株，模拟真实的检测环境，完成整个富集流程，得取细胞富集率。二、实验方法採6mL健康人外周血，加入已知数目细胞株，离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.0765本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血中的肿瘤细胞数量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)外周血样本的获得/n採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血，/n2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠/n3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集/n采集人的外周血于任何一种含抗凝剂的采血管中，离心后，去掉血浆蛋白，向其中加入包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后，颠倒混匀,室温孵育，/n加细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心，取上清液，将上清液再离心，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞，/n4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。/n

【技术特征摘要】
1.一种外周血中的肿瘤细胞数量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血，
2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集
采集人的外周血于任何一种含抗凝剂的采血管中，离心后，去掉血浆蛋白，向其中加入包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后，颠倒混匀,室温孵育，
加细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心，取上清液，将上清液再离心，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞，
4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
採用体表浅静脉负压采血法抽取静脉血，
2)向外周血样本注入已知数目的肿瘤细胞株及仿真人工合成荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，
向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，
加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，
取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，
弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞，
4)显微镜下辨认及计数余下的肿瘤细胞株及荧光圆珠，得出细胞株及荧光圆珠的富集率。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
採集6mL健康人外周血
2)向外周血样本注入20-40颗仿细胞荧光圆珠及20-40颗细胞株
3)采用以下技术对外周血肿瘤细胞进行富集及鉴别
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，
向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitroge...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，曾勇，
申请(专利权)人：王琦，曾勇，
类型：发明
国别省市：美国;US