拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型制造技术

本发明专利技术公开了拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型。本发明专利技术的细胞模型的制备方法：降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到SIRT7功能丧失的细胞模型。SIRT7功能丧失的间充质干细胞模型可用于筛选使细胞延缓衰老的分子，可作为增殖和体内留存能力减弱的相关材料用于细胞治疗。本发明专利技术也筛选出了使细胞延缓衰老的小分子3TC，可用于改善细胞模型的细胞增殖能力减弱、体内留存能力降低、衰老进程加快的表型起到延缓衰老进程的作用和用于相关疾病的治疗。

【技术实现步骤摘要】
拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于筛选延缓衰老药物的细胞模型及其制备方法，应用该细胞模型进行筛选后发现拉米夫定具有延缓衰老的作用，因此本专利技术还涉及拉米夫定在延缓衰老中的应用。
技术介绍
Sirtuins家族是一类NAD+依赖的去乙酰化酶，从古细菌到哺乳动物都高度保守。Sirtuins家族在不同的细胞过程，如细胞凋亡、线粒体生物合成、脂质代谢和衰老等都发挥着重要的作用。SIRT7作为唯一定位在核仁中的Sirtuins成员参与核糖体生物发生和应激反应等过程。SIRT7调节肝脏脂质代谢，心脏系统稳态和脂肪形成。SIRT7也作为一个转录抑制因子调节线粒体和细胞质蛋白稳态。近年来，SIRT7也被报道与基因组稳定性有关系。比如SIRT7介导H3K18ac位点的去乙酰化和H3K122succ位点的去琥珀酰化作用，被招募至DNA双链断裂处，促进染色质重塑和修复。SIRT7基因又名Sirtuin7(NAD-DependentProteinDeacetylaseSirtuin-7)，位于第17号染色体17q25.3，基因组的序列总长度约为6.2kb，编码有10个外显子以及9个内含子，可经过剪接成长度约1.7kb的mRNA。SIRT7的蛋白分子质量约为44.9kDa，其等电点约为9.8。衰老是一个复杂的过程，其特征是生理完整性和器官功能的逐步下降。导致机体衰老的一个主要因素是干细胞的衰老和衰竭，其会破坏组织的维持和损害器官的再生。人间充质干细胞维持体内其他细胞群，并具有分化为多种细胞谱系的潜能，如软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞等。人间充质干细胞的逐渐衰竭与衰老相关的组织功能障碍和变性疾病有因果关系。像Hutchinson-Gilford早衰综合征这样的早衰疾病中，间充质干细胞群也会以典型的细胞衰老特征加速衰老。染色质紊乱被认为是间充质干细胞在衰老和疾病中衰老的一个驱动因素。已有证据表明，在机体和细胞衰老过程中会出现反转录转座子的去抑制作用，如反转录转座子(LINE1)。近年来对间充质干细胞具有保护作用的小分子化学物质对啮齿动物具有延长健康寿命和缓解衰老相关症状的作用。拉米夫定(3TC)是一种逆转录酶抑制剂，以往用于艾滋病相关的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供拉米夫定在延缓衰老中的应用以及制备用于筛选延缓衰老药物的细胞模型。本专利技术首先保护拉米夫定在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)和/或(g)和/或(h)：(a)延缓衰老；(b)延缓细胞衰老；(c)延缓间充质干细胞衰老；(d)延缓SIRT7功能丧失的间充质干细胞的衰老；(e)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的克隆形成能力；(f)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的增殖能力；(g)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中衰老细胞的比例；(h)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中的反转录转座子水平。所述间充质干细胞为人间充质干细胞。所述SIRT7功能丧失的间充质干细胞具体可为下述任一所述细胞模型(间充质干细胞细胞模型)本专利技术保护一种细胞模型的制备方法，包括如下步骤：降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞，该重组细胞或其传代细胞即为细胞模型。所述传代细胞具体可为将所述重组细胞进行传代培养的细胞。所述传代培养的次数为1次或多次。本专利技术保护一种细胞模型的制备方法，包括如下步骤：(1)降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞；(2)取所述重组细胞或所述重组细胞的传代细胞，进行诱导分化，得到的细胞或其传代细胞即为细胞模型。所述重组细胞的传代细胞具体可为将所述重组细胞进行传代培养的细胞。所述传代培养的次数为1次或多次。进行诱导分化后，得到的细胞作为P1代细胞。其传代细胞具体可为P2代细胞至P10代细胞中任一所述，具体可为P3代细胞至P10代细胞中任一所述，具体可为P4代细胞至P10代细胞中任一所述，更具体可为P3代细胞、P4代细胞、P5代细胞或P6代细胞。本专利技术保护一种细胞模型的制备方法，包括如下步骤：(1)降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞；(2)取所述重组细胞或所述重组细胞的传代细胞，进行诱导分化，得到的间充质干细胞或其传代细胞即为细胞模型。所述诱导分化为向间充质干细胞的诱导分化。所述间充质干细胞为CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞。所述重组细胞的传代细胞具体可为将所述重组细胞进行传代培养的细胞。所述传代培养的次数为1次或多次。进行诱导分化后，得到的细胞作为P1代间充质干细胞。其传代细胞具体可为P2代细胞至P10代细胞中任一所述，具体可为P3代细胞至P10代细胞中任一所述，具体可为P4代细胞至P10代细胞中任一所述，更具体可为P3代细胞、P4代细胞、P5代细胞或P6代细胞。以上任一所述干细胞为全能干细胞或多能干细胞。以上任一所述干细胞为人全能干细胞或人多能干细胞。所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多能干细胞。以上任一所述干细胞为人胚胎干细胞或诱导人多能干细胞。示例性的，以上任一所述干细胞为H9细胞系。示例性的，以上任一所述重组细胞为在H9细胞系的基因组DNA中的SIRT7基因第4外显子的第20个核苷酸后插入核苷酸A得到的重组细胞。所述基因编辑通过CRISPR/Cas9系统实现。所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列位于SIRT7基因的第4外显子。所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列如序列表的序列1所示。所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA如序列表的序列2所示。以上任一所述方法中，降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性可通过如下任一种方式实现：抑制SIRT7蛋白的合成、抑制SIRT7蛋白的功能、促进SIRT7蛋白的降解。以上任一所述方法中，抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达可通过如下任一种方式实现：RNA干扰、基因沉默、基因敲除或者基因突变。以上任一所述方法中，降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性可通过如下方式实现：向干细胞中加入SIRT7蛋白抑制剂。所述SIRT7蛋白抑制剂可为抑制SIRT7蛋白合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.拉米夫定在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)和/或(g)和/或(h)：/n(a)延缓衰老；/n(b)延缓细胞衰老；/n(c)延缓间充质干细胞衰老；/n(d)延缓SIRT7功能丧失的间充质干细胞的衰老；/n(e)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的克隆形成能力；/n(f)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的增殖能力；/n(g)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中衰老细胞的比例；/n(h)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中的反转录转座子水平。/n

【技术特征摘要】
1.拉米夫定在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)和/或(f)和/或(g)和/或(h)：
(a)延缓衰老；
(b)延缓细胞衰老；
(c)延缓间充质干细胞衰老；
(d)延缓SIRT7功能丧失的间充质干细胞的衰老；
(e)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的克隆形成能力；
(f)提高SIRT7功能丧失的间充质干细胞的增殖能力；
(g)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中衰老细胞的比例；
(h)降低SIRT7功能丧失的间充质干细胞中的反转录转座子水平。


2.细胞模型的制备方法，包括如下步骤：降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞，该重组细胞或其传代细胞即为细胞模型。


3.细胞模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞；
(2)取所述重组细胞或所述重组细胞的传代细胞，进行诱导分化，得到的细胞或其传代细胞即为细胞模型。


4.细胞模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)降低干细胞中SIRT7蛋白的含量和/或降低干细胞中SIRT7蛋白的活性和/或抑制干细胞中SIRT7蛋白的编码基因的表达和/或对干细胞中SIRT7蛋白的编码基因进行基因编辑，得到重组细胞；
(2)取所述重组细胞或所述重组细胞的传代细胞，进行诱导分化，得到的间充质干细胞或其传代细胞即为细胞模型。


5.如权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于：所述干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲静，刘光慧，张维绮，毕诗佳，王思，宋默识，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11