一种载药KGN纳米纤维支架及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种载药KGN纳米纤维支架及其制备方法和应用，属于生物支架制备领域。本发明专利技术公开了一种载药KGN纳米纤维支架，首先在丝素蛋白(SF)纳米纤维表面修饰聚多巴胺(PD)，利用PD的氨基基团和活性药物KGN的羧基基团，通过EDC/NHS酰胺缩合反应将KGN装载到纳米纤维表面，能够实现早期能够消除氧化应激并降低炎症反应，促进炎症期向组织新生与重塑期的转变；同时在中后期持续缓释KGN，诱导纤维软骨组织的形成，最终实现界面组织的再生；另外体外实验结果证明本发明专利技术载药KGN纳米纤维支架具有炎症调节功能，可以促进骨‑肌腱界面组织纤维软骨的形成，在界面组织工程中具有极大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种载药KGN纳米纤维支架及其制备方法和应用
本专利技术属于生物支架制备领域，具体涉及一种载药KGN纳米纤维支架及其制备方法和应用。
技术介绍
肌腱骨骼系统的界面组织可以划分为三大区域，分别是：(1)骨；(2)纤维软骨；(3)肌腱/韧带，其中纤维软骨因其能够缓冲冲击，最大限度削弱应力集中，进而在对力学负荷的有效传递起着至关重要的作用。日常的体力活动中很容易引起骨-肌腱/韧带等界面组织的损伤，而当骨与肌腱/韧带通过手术再次直接结合时，界面区域原有的组织结构、生物功能及微环境丧失，使得二者不能有效地相互整合，且稳定性差，再次损伤率高，成为临床上的重要困难。组织损伤后的修复过程会经历三个重要时期，分别是：(1)炎症期；(2)组织新生期；(3)组织重塑期。在早期的炎症阶段，以中性粒细胞为主的，包括淋巴细胞、单核细胞以及巨噬细胞等会抵达损伤部位，以抑制外源感染并清除坏死组织细胞。然而这些炎症细胞会向组织周围环境中释放的蛋白酶和活性氧会对成纤维细胞类细胞造成严重的损伤，使得胶原蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)分泌沉积受阻，进而不利于组织的愈合恢复。此外，损伤后初始炎症期到后续组织新生与重塑期的及时过渡亦是组织修复的关键调节点[170]；同时在组织新生与重塑阶段，许多化学、力学及细胞信号会参与修复进程，包括细胞的迁移、增殖及特定方向的引导分化。特别地，由于界面组织结构与功能的特性，损伤后的自我修复引导能力不足，多形成疤痕血管性组织，无法满足力学负荷传递的生物功能。基于此过程，设想降低组织损伤后的早期炎症反应，加快炎症期向组织新生与重塑期的转变；同时在中后期提供一个有利于细胞粘附、增殖且能够引导细胞向纤维软骨定向分化的局部微环境，进而促进界面组织的再生，恢复界面组织的生物功能。生物材料应用作为一种理想的组织工程策略，具有调控损伤组织修复与再生的潜力。SF纳米纤维支架(丝素纳米纤维支架)作为仿生ECM(细胞外基质)结构的生物材料，具有良好的生物相容性和力学性质，通过不同的表面修饰，能够具有不同的功能特性，在组织工程中能实现期望的调控作用。纳米纤维表面的PD涂层(聚多巴胺涂层)具有良好的稳定性和抗氧化性，能够抑制ROS(活性氧reactiveoxygenspecies)引起的炎症反应。此外，PD(聚多巴胺)自身丰富的基团，如邻茶二酚、氨基、亚氨基等，可以为进一步的表面修饰提供结合位点，基于此PD作为生物活性化合物也得到了广泛的研究。Kartogenin(KGN)，是近几年发现的一种疏水性小分子药物，早期研究其可以促进间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)向软骨样细胞分化，诱导软骨组织再生。后续研究发现KGN对界面组织的修复也有促进作用，可以诱导界面纤维软骨的形成。作为一种无毒、性能稳定的合成小分子，KGN自身具有羧基基团，可以与氨基共价结合，能够简便地装载于生物材料。药物缓释的策略不仅能够提高药物的稳定性与利用度，还具有定向、持续时间长等优势。综上述内容，基于还原性PD涂层丰富的氨基结构，将具有软骨诱导功能的小分子药物KGN装载到SF纳米纤维上设计并构建一种载药KGN纳米纤维支架。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种载药KGN纳米纤维支架；本专利技术的目的之二在于提供一种载药KGN纳米纤维支架的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供一种载药KGN纳米纤维支架在界面组织工程中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种载药KGN纳米纤维支架，所述纳米纤维支架包含丝素(SF)纳米纤维支架、所述支架表面修饰的聚多巴胺(PD)涂层以及与所述聚多巴胺涂层交联的2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(KGN)。优选的，所述交联具体为：通过酰胺缩合反应使得KGN与聚多巴胺(PD)发生共价交联，进而将KGN引入到纳米纤维材料上形成载药KGN纳米纤维支架。2.上述一种载药KGN纳米纤维支架的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架；(2)制备载药KGN纳米纤维支架：将表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架侵入活化的KGN溶液中，搅拌反应至少24h后取出，洗涤即可得到载药KGN纳米纤维支架。优选的，步骤(1)中所述表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架按照如下方法制备：a、将片状蚕茧在0.5％的NaHCO3水溶液中煮沸后用双蒸水冲洗；b、重复步骤a中的操作得到脱胶的蚕丝，然后将其置于烘箱中干燥；c、将干燥的蚕丝置于由CaCl2、CH3CH2OH和H2O按照1:2:8的摩尔比组成的三元体系中蒸煮至完全溶解，用孔径为4.5um的膜过滤，双蒸水透析以除去其它离子，得到溶液进行冷冻干燥即为海绵状态的纯净丝素蛋白，在-20℃下保存备用；d、将步骤c中的纯净丝素蛋白放入六氟异丙醇中，搅拌至溶液清澈透明得到丝素静电纺丝溶液；e、用静电纺丝仪将丝素静电纺丝溶液制备得到丝素纳米纤维支架，晾干后于室温下保存备用。进一步优选的，所述方法具体如下：a、将0.5cm×0.5cm的片状蚕茧在0.5％的NaHCO3水溶液中煮沸30min后用双蒸水冲洗；b、重复步骤a中的操作得到脱胶的蚕丝，将其置于烘箱中干燥；c、将干燥的蚕丝置于55gCaCl2、58.2ml无水乙醇、72ml三蒸水的混合形成的三元体系中，在70℃下加热至6h，使蚕丝完全溶解，得到浓度为10％的丝素溶液，经过孔径为4.5um的膜过滤、双蒸水透析3d且每6h更换双蒸水以除去其它离子，得到溶液进行冷冻干燥即为海绵状态的纯净丝素蛋白，在-20℃下保存备用；d、按照1:10，g:ml的比例将步骤c中制备的纯净丝素蛋白溶于六氟异丙醇中，在磁力搅拌器上搅拌3d得到零度为10％的六氟异丙醇中的丝素静电纺丝溶液；e、用注射器吸入丝素静电纺丝溶液，使用22G点胶针于静电纺丝仪器上制备SF纳米纤维，设置静电纺丝仪参数为：注射速率为1mL/h、接收器转速200rpm、电压15kV、接收距离8cm，得到丝素纳米纤维支架，晾干后于室温下保存备用。优选的，步骤(2)中所述活化的KGN溶液按照如下方法制备：向2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中加入KGN储存液，搅拌均匀后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)，搅拌活化至少30min即可得到所述活化的KGN溶液。优选的，所述2-吗啉乙磺酸、KGN、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的质量比为310:1:180:66。进一步优选的，所述2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中2-吗啉乙磺酸的浓度为0.1mol/L。进一步优选的，所述2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液按照如下方法配制：按照1:5的摩尔比将MES(2-吗啉乙磺酸)和29.22gNaCl加入去离子水中，搅拌至完全溶解，用NaOH溶液调节pH至5.5～6.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种载药KGN纳米纤维支架，其特征在于，所述纳米纤维支架包含丝素纳米纤维支架、所述支架表面修饰的聚多巴胺涂层以及与所述聚多巴胺涂层交联的2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种载药KGN纳米纤维支架，其特征在于，所述纳米纤维支架包含丝素纳米纤维支架、所述支架表面修饰的聚多巴胺涂层以及与所述聚多巴胺涂层交联的2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸。


2.根据权利要求1所述的一种载药KGN纳米纤维支架，其特征在于，所述交联具体为：通过酰胺缩合反应使得2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸与聚多巴胺发生共价交联，进而将2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸引入到纳米纤维材料上形成载药KGN纳米纤维支架。


3.权利要求1～2任一项所述一种载药KGN纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架；
(2)制备载药KGN纳米纤维支架：将表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架侵入活化的2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶液中，搅拌反应至少24h后取出，洗涤即可得到载药KGN纳米纤维支架。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面修饰聚多巴胺的丝素纳米纤维支架按照如下方法制备：
a、将片状蚕茧在0.5％的NaHCO3水溶液中煮沸后用双蒸水冲洗；
b、重复步骤a中的操作得到脱胶的蚕丝，然后将其置于烘箱中干燥；
c、将干燥的蚕丝置于由CaCl2、CH3CH2OH和H2O按照1:2:8的摩尔比组成的三元体系中蒸煮至完全溶解，进行膜过滤和双蒸水透析以除去其它离子，得到溶液进行冷冻干燥即为海绵状态的纯净丝素蛋白，在-20℃下保存备用；
d、将步骤c中的纯净丝素蛋白放入六氟异丙醇中，搅拌至溶液清澈透明得到丝素静电纺丝溶液；
e、用静电纺丝仪将丝素静电纺丝溶液制备得到丝素纳米纤维支架，晾干后于室温下保存备用。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体如下：
a、将0.5cm×0.5cm的片状蚕茧在0.5％的NaHCO3水溶液中煮沸30min后用双蒸水冲洗；
b、重复步骤a中的操作得到脱胶的蚕丝，将其置于烘箱中干燥；
c、将干燥的蚕丝置于55gCaCl2、58.2ml无水乙醇、72ml三蒸水的混合形成的三元体系中，在70℃下加热至6h，使蚕丝完全溶解，得到浓度为10％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨力，陈培兴，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50