一种DcR3的定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，公开了一种DcR3的定量检测试剂盒。与现有DcR3ELISA检测试剂盒相比，本发明专利技术所述的DcR3的定量检测试剂盒具有检测灵敏度高、检测限低的优势，可直接用于人血清中DcR3的含量检测，从而可直接用于肿瘤的筛查、预后判断和治疗指导。此外，本发明专利技术中所使用的抗体均为单克隆抗体，与使用多克隆抗体的试剂盒相比，各批次样品间具有很高的品质均一性。

A quantitative detection kit for DcR3

【技术实现步骤摘要】
一种DcR3的定量检测试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，具体公开了一种DcR3的定量检测试剂盒。
技术介绍
死亡诱骗受体3(Decoyreceptor3，DcR3)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是一种可溶性受体，能够与肿瘤坏死因子家族成员(如：Fas配体、TL1A、LIGHT等)竞争性结合，从而导致机体对肿瘤细胞和活化的自身免疫细胞的耐受。研究发现DcR3在肿瘤患者血清及组织中浓度的高低与其恶性度呈正相关，检测术后患者血清中DcR3水平可作为肿瘤切除彻底与否的重要指标(刘瑞振，张长弓etal.2009)。此外，DcR3与肿瘤转移密切相关，是诊断癌症转移的理想肿瘤标志物(Li,Xieetal.2017)。因此，开发基于检测DcR3肿瘤标志物的ELISA诊断试剂盒，有助于癌症的筛查、预后判断和治疗指导。检测DcR3含量的ELISA试剂盒一般采用双抗体夹心法，其基本原理为将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。目前市场上有几个人DcR3ELISA检测试剂盒产品在售，包括：R&DSystems公司、Invitrogen公司、Abcam公司、Boster公司等。但是这些市场上售的DcR3ELISA检测试剂盒的灵敏度不够高，检测限不够低。并且有的公司ELISA试剂盒所使用的抗体为多克隆抗体，不能够保证各批次样品间具有很高的品质均一性。r>
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术灵敏度低、检测线高的问题，，提供一种DcR3的定量检测试剂盒。一种DcR3的定量检测试剂盒，包括DcR3单克隆抗体、生物素标记的二抗、链酶亲和素-过氧化物酶。本专利技术所述试剂盒中，所述亲和素作为“桥”与生物素化的抗体和生物素结合的酶连接起来，即形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物)，检测时待测样品中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合物，使抗原与抗体反应信号放大，以增加灵敏度。作为优选，所述DcR3单克隆抗体为鼠源的DcR3单克隆抗体、兔源的DcR3单克隆抗体或羊源的DcR3单克隆抗体。作为优选，所述DcR3单克隆抗体为单克隆杂交瘤细胞7A51H2或IB7产生的单克隆抗体。作为优选，所述DcR3单克隆抗体经磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成工作浓度4μg/ml。作为优选，所述生物素标记的二抗为生物素标记的鼠抗人DcR3单克隆抗体。进一步的，本专利技术所述DcR3的定量检测试剂盒，还包括显色液TMB、PBS、1MH2SO4、脱脂奶粉、含0.05％Tween-20的PBS。。本专利技术还提供了一种DcR3的定量检测方法，包括如下步骤：(1)以DcR3单克隆抗体作为一抗包被酶标板，洗涤后封闭液封闭；(2)洗涤后加入待测样品，室温孵育2h；(3)洗涤后加入生物素标记的二抗，室温孵育2h；(4)洗涤后加入链酶亲和素-过氧化物酶，避光孵育20min；(5)洗涤后加入显色液TMB，避光孵育20min，终止反应，酶标仪读取450nm处的OD值。与现有DcR3ELISA检测试剂盒相比，本专利技术所述的DcR3的定量检测试剂盒具有检测灵敏度高、检测限低的优势，可直接用于人血清中DcR3的含量检测，从而可直接用于肿瘤的筛查、预后判断和治疗指导。此外，本专利技术中所使用的抗体均为单克隆抗体，与使用多克隆抗体的试剂盒相比，各批次样品间具有很高的品质均一性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1纯化后的DcR3抗体SDS-PAGE电泳图；图2示实施例1纯化后的DcR3抗体高效液相色谱图。具体实施方式本专利技术公开了一种DcR3的定量检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。为了进一步理解本专利技术，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如无特殊说明，本专利技术实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1、人DcR3单克隆抗体的制备采用杂交瘤法进行制备。用人全长DcR3与IgG1Fc结构域的融合蛋白(北京义翘神州科技有限公司提供)作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠(6周龄)，首次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5～6点注射，每只小鼠注射的抗原量为100μg。在第3次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价ELISA检测，选择抗体滴度高(>1:100000)的小鼠进行加强第4次免疫，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射100μg。第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与SP2/0细胞融合，通过HAT培养基培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过ELISA法筛选得到能分泌DcR3抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，ELISA法筛选得到能分泌DcR3抗体的单克隆杂交瘤细胞两株7A51H2和IB7，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。腹水抗体制备：雌性BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml，3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射(1～5)×105个细胞(0.5ml)，注射杂交瘤细胞11天后处死小鼠，获得腹水。3000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×PB溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过ProteinG(ProteinGSepharose4FastFlow,GEHealthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的DcR3抗体蛋白，用BCA法测抗体浓度。将纯化抗体进行SDS-PAGE(上样量5.4μg)电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图1所示。将纯化的抗体用高效液相色谱法检测其纯度，结果如图2所示。实施例2、人DcR3亲和素-生物素-过氧化物酶复合物ELISA检测试剂盒试剂盒包括鼠抗人DcR3-7A51H2抗体、鼠抗人DcR3-IB7-Biotin、Streptavidin-HRP(200倍)、显色液TMB、脱脂奶粉、1MH2SO4、PBS、含0.05％Tween-20的PBS。实施例3、人DcR3亲和素-生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DcR3的定量检测试剂盒，包括DcR3单克隆抗体、生物素标记的二抗、链酶亲和素-过氧化物酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种DcR3的定量检测试剂盒，包括DcR3单克隆抗体、生物素标记的二抗、链酶亲和素-过氧化物酶。


2.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，所述DcR3单克隆抗体为鼠源的DcR3单克隆抗体、兔源的DcR3单克隆抗体或羊源的DcR3单克隆抗体。


3.根据权利要求1所述的定量检测试剂盒，所述DcR3单克隆抗体为单克隆杂交瘤细胞7A51H2或IB7产生的单克隆抗体。
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【专利技术属性】
技术研发人员：万晓春，陈有海，李俊鑫，刘绿艳，刘茂玄，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44