一种构建双识别位点纳米孔的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建双识别位点纳米孔的方法，包括：对融合表达的两种单识别位点纳米孔进行结构域功能分析，获得结构域分析结果；选择结构域基因，进行融合蛋白设计，获得具有两个识别位点的融合蛋白；选择保证融合蛋白结构稳定及可聚合的表达系统，根据表达系统的宿主种类，并依次完成表达方案设计、表达条件优化、孔道蛋白聚合、纯化分离、嵌孔及测序以及融合蛋白突变的处理；本申请使用天然存在的单识别位点的纳米孔蛋白，通过工程化的融合蛋白表达技术，获得双识别位点的纳米孔道蛋白，大大扩展了纳米孔蛋白的可选择范围，解决了天然存在的双敏感位点的蛋白纳米孔极少的问题。通过突变了优化孔道的性能，提高孔道的检测性能。

【技术实现步骤摘要】
一种构建双识别位点纳米孔的方法
本专利技术涉及纳米孔检测
，尤其涉及一种构建双识别位点纳米孔的方法。
技术介绍
天然生物膜上存在一类跨膜蛋白通道，该蛋白通道具有纳米尺度的直径，允许离子及特定大小分子穿过，称为纳米孔。将纳米孔蛋白嵌在绝缘的人工薄膜上，置于导电离子液体中，并在薄膜两侧施加电压，则带电离子将穿越纳米孔道形成离子电流。当有特定大小的分子穿过通道或结合到孔道上时，会阻塞孔道从而降低离子流，阻塞电流的大小与分子尺寸、电荷分布等特征信息相关,因此可通过测量阻塞电流的大小来识别分子。运用这一原理，当核酸或者其他分析物在电压的作用下瞬时穿过蛋白纳米孔道时，通过测量碱基序列穿过孔道的阻塞电流变化就能实现核酸测序。现有的高通量测序技术需通过酶扩增和荧光标记的过程，因此具有速度慢、价格贵的缺点。相较于现有的测序方法，纳米孔测序无需扩增，单分子即可测量，具有快速、低成本、长读长、高灵敏度等特点。已有部分蛋白纳米孔道用于核酸等多聚物的检测，例如用于核酸检测的突变体α-溶血素纳米孔(可参考下列文件：CN10710947本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建双识别位点纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n基于预先准备或融合表达蛋白的基因序列，使用结构域分析工具对融合表达的两种单识别位点纳米孔进行结构域功能分析，获得结构域分析结果；/n根据所述结构域分析结果，选择结构域基因，进行融合蛋白设计，获得具有两个识别位点的融合蛋白，使所述具有两个识别位点的融合蛋白包括磷脂膜结合结构域；/n选择保证融合蛋白结构稳定及可聚合的表达系统，根据表达系统的宿主种类，对融合蛋白基因序列进行密码子优化，对融合蛋白基因序列的不同的表达质粒及表达菌株组合进行优化，获得融合蛋白的成功表达，在融合蛋白末端设计纯化标签以实现蛋白表达后的纯化；/n通过优化表达条件...

【技术特征摘要】
1.一种构建双识别位点纳米孔的方法，其特征在于，包括以下步骤：
基于预先准备或融合表达蛋白的基因序列，使用结构域分析工具对融合表达的两种单识别位点纳米孔进行结构域功能分析，获得结构域分析结果；
根据所述结构域分析结果，选择结构域基因，进行融合蛋白设计，获得具有两个识别位点的融合蛋白，使所述具有两个识别位点的融合蛋白包括磷脂膜结合结构域；
选择保证融合蛋白结构稳定及可聚合的表达系统，根据表达系统的宿主种类，对融合蛋白基因序列进行密码子优化，对融合蛋白基因序列的不同的表达质粒及表达菌株组合进行优化，获得融合蛋白的成功表达，在融合蛋白末端设计纯化标签以实现蛋白表达后的纯化；
通过优化表达条件，获得折叠完整的融合蛋白；
通过优化纯化方法，获得高纯度的融合蛋白单体或聚合体；
使用试剂对在融合蛋白表达后为单体表达的蛋白进行诱导，获得组装成聚合体形式的蛋白；
对融合表达后的蛋白单体和组装成聚合体形式的蛋白进行纯化分离；
使用包含已经进行纯化分离处理的融合蛋白、膜层和电流测量装置的测试系统，利用电流表征的手段进行分析物的检测和表征；
通过突变对融合表达的双识别位点纳米孔蛋白的孔道内部的结构、电荷状态及亲疏水性进行优化，对突变后的蛋白进行表达后用于分析物检测与表征。


2.根据权利要求1所述的构建双识别位点纳米孔的方法，其特征在于，所述获得具有两个识别位点的融合蛋白的步骤之后还包括：
选用蛋白三维结构模拟软件进行模拟，获得融合蛋白的三维结构，根据三维结构预测融合蛋白的折叠效果。


3.根据权利要求1所述的构建双识别位点纳米孔的方法，其特征在于，所述获得具有两个识别位点的融合蛋白的步骤之后还包括：
将来源于不同纳米孔蛋白的结构域通过连接序列连接或进行直接连接。


4.根据权利要求1所述的构建双识别位点纳米孔的方法，其特征在于，所述使用试剂对在融合蛋白表达后为单体表达的蛋白进行诱导的步骤还包括，使用兔红细胞膜或脂质体或两亲性的化...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周智，
申请(专利权)人：深圳市梅丽纳米孔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44