一种化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法技术

本发明专利技术属于分析化学和化学发光传感器领域，以(CH

【技术实现步骤摘要】
一种化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法
本专利技术属于分析化学和化学发光传感器领域，涉及PtCu模拟酶制备方法，结合适体识别作用和化学发光测定技术建立一种测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法。
技术介绍
模拟酶是一类非蛋白结构但与天然酶有相似催化活性的人工合成催化剂，其克服了天然酶稳定性差、易变性失活、贮存困难、制备工艺复杂和价格昂贵等缺点。其中铂纳米对于鲁米诺-过氧化氢化学发光体系有很好的催化效果，但因为铂作为贵金属使得其应用有限制。脱氧雪腐镰刀菌烯醇，也称呕吐毒素(DON)是各国谷物中检出率最高的一种真菌毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇属于单端孢霉烯族毒素，是小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物及其制品中最常见的一类污染性真菌毒素，其主要产毒真菌为禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等。由于具有引发动物呕吐的特征，脱氧雪腐镰刀菌烯醇也被称为呕吐毒素。谷物脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染全球范围内易多发，主要原因是谷物在田间受到禾谷镰刀菌等真菌侵染，导致小麦发生赤霉病和玉米穗腐病，在适宜的气温和湿度等条件下繁殖并产毒。我国麦类及其他谷物赤霉病的流行主要分布于长江以南区域，呈间歇性爆发状态，在长江、淮河、黄河流域呈多发态势。脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物和人均有一定毒性。低剂量脱氧雪腐镰刀菌烯醇可能引起动物的食欲下降、体重减轻、代谢紊乱等，大剂量可导致呕吐。人摄食被脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的谷物制成的食品后可能会引起呕吐、腹泻、头疼、头晕等以消化系统和神经系统为主要症状的真菌毒素中毒症。全球高度重视谷物及制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的控制。由于脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染广泛存在，很多国家和地区都按照谷物形态种类和加工用途制定了脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准。欧盟规定的脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量范围为200-1750μg/kg。2015年国际食品法典委员会首次颁布了脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准，规定未加工的谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量为2000μg/kg，谷物制品中限量为1000μg/kg，谷物基婴幼儿食品中限量为200μg/kg。我国规定了小麦等制品脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许限量≤1000μg/kg。现有检测方法主要有免疫抗体法，但是抗体具有价格昂贵、不易储藏等缺点。本专利技术设计合成PtCu二元合金纳米复合材料，以其为模拟酶实现对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系信号的增强。并以PtCu-鲁米诺-过氧化氢化学发光体系和适体识别作用对脱氧雪腐镰刀菌烯醇实现了测定。具有方法简单、成本低、灵敏度高的优点。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种PtCu模拟酶制备方法，结合适体识别作用和化学发光测定技术建立了一种测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法。本专利技术的目的是这样实现的：以(CH3COO)2Cu·H2O和K2PtCl6为原材料，淀粉离心液作为稳定剂，抗坏血酸为还原剂，用水溶液法合成了PtCu二元合金纳米复合材料；以PtCu为标记物，利用适体识别作用，构建了测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇新方法。技术方案一种化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征在于以PtCu催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，用PtCu修饰适体互补DNA为探针，以氨基化磁珠为载体，以适体识别作用实现DON测定，测定步骤如下：(1)PtCu二元合金纳米复合材料的制备取0.1g-50.0g的淀粉于烧杯中，加入1mL-500mL的超纯水，将烧杯放入恒温加热磁力搅拌器中，在30℃-80℃条件下水浴加热搅拌，0.1h-2.5h之后在4000rpm-25000rpm的转速下离心1min-60min，收集上清液。(CH3COO)2Cu·H2O和K2PtCl6加烧杯中；并加入上述所得的淀粉上清液，室温下匀速搅拌；同时缓慢滴加抗坏血酸溶液。滴加完之后继续搅拌1h-5h后停止搅拌，静置。随后将所得产物在4000rpm-25000rpm下离心2min-60min。除去离心液，沉淀用无水乙醇分散，并超声再离心，依次反复两次；再将沉淀用超纯水分散，并超声再离心一次，然后用超纯水分散沉淀即得PtCu溶液。(2)化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇(a)功能化磁珠的制备。在2mL的样品管中加入含2μg捕获DNA溶液，再加入1000μL含0.1M的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化30min；另取一个10mL的小烧杯，加入50μL氨基化磁珠(直径为0.5μm～3μm)，2000μL咪唑缓冲液(0.1M，pH为6.8)，活化30min；将上述两溶液混合反应12h，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，用磷酸缓冲溶液定容至500μL，得到捕获DNA标记磁珠溶液，即功能化磁珠溶液；(b)探针的制备。在PBS中加入1mLPtCu溶液，再加入10mgNHS、20mgEDC，将该混合液在37℃下搅拌1h，然后加入1mL适体互补DNA溶液，在室温下搅拌12h-18h，离心并将沉淀分散于PBS中，得到适体互补DNA标记PtCu溶液，即探针溶液；(c)化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。取功能化磁珠溶液和探针溶液，在37℃下孵育2h，离心分离取沉淀分散于PBS中。随后加入含目标物脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准溶液，37℃孵育2h，在转速为14000rpm条件下离心分离后吸上清液，上清液用磷酸缓冲定容，然后将其注入含鲁米诺-过氧化氢的溶液中进行化学发光测定，根据化学发光信号对DON进行定量。根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；(3)样品分析。将谷物中的DON提取，按步骤(2)方法进行实验，根据化学发光信号和步骤(2)所得标准曲线可以获DON的含量。本专利技术的DNA序列如下：DON适体：5'-HOOC-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGC-3'适体互补DNA：5'-CGATCCCCCCTACGATGCGTAATGACTGTAGTGATGC-SH-3'本专利技术的化学试剂优选分析纯试剂，所有溶液均用二次蒸馏水配置。本专利技术的磷酸缓冲溶液为0.2M(pH7.4)，由NaH2PO4溶液和Na2HPO4溶液混合得到。本专利技术的PBS缓冲溶液为0.2M(pH7.4)，由NaH2PO4溶液、Na2HPO4溶液混合得到，并含有体积浓度为0.9％的KCl。本专利技术的化学发光测定选用MPI-E型化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)。本专利技术的振荡孵育选用THZ-82A气浴恒温振荡器(全坛市医疗仪器厂)。本专利技术的离心机选用Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(上海市安亭科学仪器厂)。本专利技术的pH测量选用PHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)。本专利技术的显著效果本专利技术研究了不同浓度DON与发光强度之间的关系，得到了检测DON的标准曲线，线性范围及线性方程。当DON的浓度在0.1ng/mL-10μg/mL之间时，随着DON浓度的变化，化学发光强度有明显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征在于以PtCu催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，用PtCu修饰适体互补DNA为探针，以氨基化磁珠为载体，以适体识别作用实现DON测定，测定步骤如下：/n(1)PtCu二元合金纳米复合材料的制备/n取0.1g-50.0g的淀粉于烧杯中，加入1mL-500mL的超纯水，将烧杯放入恒温加热磁力搅拌器中，在30℃-80℃条件下水浴加热搅拌，0.1h-2.5h之后在4000rpm-25000rpm的转速下离心1min-60min，收集上清液；(CH

【技术特征摘要】
1.一种化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，其特征在于以PtCu催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，用PtCu修饰适体互补DNA为探针，以氨基化磁珠为载体，以适体识别作用实现DON测定，测定步骤如下：
(1)PtCu二元合金纳米复合材料的制备
取0.1g-50.0g的淀粉于烧杯中，加入1mL-500mL的超纯水，将烧杯放入恒温加热磁力搅拌器中，在30℃-80℃条件下水浴加热搅拌，0.1h-2.5h之后在4000rpm-25000rpm的转速下离心1min-60min，收集上清液；(CH3COO)2Cu·H2O和K2PtCl6加烧杯中；并加入上述所得的淀粉上清液，室温下匀速搅拌；同时缓慢滴加抗坏血酸溶液；滴加完之后继续搅拌1h-5h后停止搅拌，静置；随后将所得产物在4000rpm-25000rpm下离心2min-60min；除去离心液，沉淀用无水乙醇分散，并超声再离心，依次反复两次；再将沉淀用超纯水分散，并超声再离心一次，然后用超纯水分散沉淀即得PtCu溶液；
(2)化学发光测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇
(a)功能化磁珠的制备：在2mL的样品管中加入含2μg捕获DNA溶液，再加入1000μL含0.1M的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺，活化30min；另取一个10mL的小烧杯，加入50μL直径为0.5μm～3μm氨基化磁珠，2000μL0.1M6.8咪唑缓冲液，活化30min；将上述两溶液混合反应12h，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，用磷酸缓冲溶液定容至500μL，得到捕获DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，高杰，张跃，李鹏利，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37