烟草品种的DNA指纹图谱库及其应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草品种的DNA指纹图谱库，所述DNA指纹图谱库包括101个特异性SNP位点；并且本发明专利技术还提供了采用所述DNA指纹图谱库在烟草品种鉴定中的应用。本发明专利技术提供的DNA指纹图谱库以及特定烟草品种的DNA指纹图谱基于简化基因组测序得到，用于烟草品种鉴定时，与传统的外观、评吸鉴定方法相比，可以提供更加客观、更加准确、更加可靠的鉴定结果。

【技术实现步骤摘要】
烟草品种的DNA指纹图谱库及其应用
本专利技术涉及分子生物学研究领域，具体而言，本专利技术涉及烟草品种的DNA指纹图谱库及其在烟草品种鉴定中的应用。
技术介绍
为了依法处理烟草原料的走私和违法销售，需要对依法罚没的烟草原料进行鉴别检验。目前在烟草原料的鉴别检验工作中，烟叶状的样品基本上是通过外观、评吸等主观手段进行。为了提升鉴别检验的准确性，已经进行了烟草DNA鉴别检验的研究。由于在DNA分子水平，不同物种间甚至是同一物种不同个体之间都能得到很好的区分，因此DNA分子技术作为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用于属间、种间、品种间的分类鉴定和亲缘关系研究中，几乎可以对所有的生物种类进行分类鉴定，在目前物种鉴定技术中发展最快，也最为热门。目前DNA分子鉴定技术已有数十种之多，如限制性片段长度多态性标记、随机扩增多态性标记、序列特异性扩增区域标记、内含子长度多态性标记、单核苷酸多态性、简单序列重复标记等。目前用于烟草鉴定的DNA分子技术主要就是SSR标记技术和SNP标记技术。SSR标记技术是目前应用最为广泛的DNA分子鉴定方法，但是由于SSR标记所承载的遗传信息有限，以SSR标记来进行鉴定，为了保障鉴定结果的可靠性，往往需要设计多达十几到二十多对的引物，引物的设计开发比较复杂，并需要大量的验证试验，这就造成前期引物设计周期长，实验验证工作量大，后期鉴定时操作比较繁琐，鉴定通量低，并且在稍复杂的鉴定中，还是需要测序来验证检验结果的准确性。SNP标记技术包括质谱法、芯片法等，质谱法所采用的质谱设备昂贵且检测通量低，芯片法成本较高，且需要进行基因芯片的定制，实验操作比较复杂。受益于当前测序技术的进步和成本的大幅度降低，以测序法进行烟草DNA鉴定成为可能。测序法主要包括简化基因组测序法和全基因组重测序法，这两种方法都能够比较全面的获取被检样品的遗传信息，区别在于简化基因组测序所需要的位点数较少，覆盖基因组的5％-10％即可，而全基因组重测序则需要获得整个基因组的遗传变异信息，需要的数据量大，成本高，结合烟草DNA鉴定的实际情况，简化基因组测序已经完全可以满足鉴定要求。开发烟草品种的新型DNA鉴定方法对于提升相关品种鉴定的准确性、对于推动烟草DNA鉴别检验工作的发展具有积极的意义。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种可用于鉴定烟草品种的DNA指纹图谱库，所述DNA指纹图谱库包括品种特异性的SNP位点。此外，中国烟草的两大类型为晾晒烟和烤烟，前者以宁乡晒烟为典型品种，后者以中烟103和云烟87为典型品种。在实际鉴定工作中这几类烟草的鉴定需求大，鉴定难度高，因此本专利技术的目的还在于提供这些特定烟草品种的DNA指纹图谱。本专利技术的技术方案如下。一方面，本专利技术提供一种烟草品种的DNA指纹图谱库，所述DNA指纹图谱库包括如下101个特异性SNP位点：另一方面，本专利技术还提供所述指纹图谱库的建立方法，包括以下步骤：(1)收集烟草品种种质共131个，见表1，取新鲜烟叶分别提取基因组DNA，然后以限制性内切酶SacI和MseI分别对基因组DNA进行酶切；(2)将步骤(1)得到的酶切片段与测序接头相连接后纯化，选择长度在320-420bp范围内的片段，富集扩增并测序，其中采用IlluminaNovaSeq测序系统，原始测序读长为Paired-end150bp，测序数据为FASTQ格式；(3)从ftp：//ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/assembly/获得典型烟草品种的基因组，使用其scaffold水平作为参考基因组，选取长度≥1kb的scaffold，共371,419条，总长4.2Gb，用限制性内切酶SacI和MseI进行模拟酶切，选择片段双端分别为两个酶切位点且片段长度为200-600bp的片段，共获得片段355,695个；(4)将步骤(2)得到的原始reads使用软件FastQCv0.11.5进行质量统计，并使用软件Trimmomatic-0.38进行过滤，过滤参数如下：a.双末端测序前端去掉前5个碱基，双末端测序后端去掉前3个碱基；b.从头开始去掉质量小于20的碱基，直到出现质量大于20的碱基为止，从结尾开始去掉质量小于20的碱基，直到出现质量大于20的碱基为止；c.如果5个相连碱基平均质量小于20，则去掉此5个碱基；d.Read最小长50bp；e.Reads平均质量大于20；(5)进行DNA指纹图谱库的构建，包括：(5-1)用BWA+GATK流程检测步骤(4)得到的reads的变异，包括1，219,877个indel和2,222,588个SNP；(5-2)选择所述SNP，按照“QD＜2.0||FS＞60.0||MQ＜40.0||MQRankSum＜-12.5||ReadPosRankSum＜-8.0||QUAL＜40”对低质量的SNP进行过滤，得到978,426个高质量SNP；(5-3)使用vcftools过滤掉等位基因频率小于0.05、群体中缺失率大于20％的SNP，得到104,788个SNP；(5-4)计算每个SNP的多态性信息含量(PIC)值，选择PIC值大于0.35的SNP，得到65,582个SNP；(5-5)依据参考基因组Scaffold的数量及其长度，选择大于50Kb的Scaffold上的SNP，得到44,122个SNP；(5-6)对所述SNP进行注释，选择在基因编码区的SNP，得到746个SNP，过滤掉杂合度大于5％的SNP，得到101个SNP。另一方面，本专利技术还提供一种烟草品种的DNA指纹图谱的建立方法，所述建立方法包括：基于本专利技术提供的指纹图谱库，检测所述烟草的标准品种对应SNP位点上的特异性核苷酸，得到所述烟草品种的DNA指纹图谱。由此，再一方面，本专利技术还提供通过所述建立方法得到的DNA指纹图谱。以及，另一方面，本专利技术还提供所述DNA指纹图谱库或DNA指纹图谱在鉴定烟草品种中的应用。根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供宁乡晒烟的DNA指纹图谱，所述DNA指纹图谱包括101个SNP位点，所述SNP位点及其上的特异性核苷酸如下：上述DNA指纹图谱可用于鉴定宁乡晒烟，因此本专利技术还提供所述DNA指纹图谱在鉴定宁乡晒烟中的应用。因此，本专利技术还提供一种宁乡晒烟的鉴定方法，所述鉴定方法包括以下步骤：检测待测烟草的基因组DNA中本专利技术所提供的DNA指纹图谱库中的101个SNP位点，并与宁乡晒烟DNA指纹图谱中所述位点上的特异性核苷酸相比较，符合率≥95％时将待测烟草鉴定为宁乡晒烟。其中优选地，从待测烟草的新鲜烟叶中获得所述基因组DNA。根据本专利技术的具体实施方式，本专利技术提供中烟103的DNA指纹图谱，所述DNA指纹图谱包括101个SNP位点，所述SNP位点及其上的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草品种的DNA指纹图谱库，所述DNA指纹图谱库包括如下101个特异性SNP位点：/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草品种的DNA指纹图谱库，所述DNA指纹图谱库包括如下101个特异性SNP位点：








2.权利要求1所述的指纹图谱库的建立方法，所述建立方法包括以下步骤：
(1)收集烟草品种种质131个，见表1，取新鲜烟叶分别提取基因组DNA，然后以限制性内切酶SacI和MseI对基因组DNA进行酶切；
(2)将步骤(1)得到的酶切片段与测序接头相连接后纯化，选择长度在320-420bp范围内的片段，富集扩增并测序，其中采用IlluminaNovaSeq测序系统，原始测序读长为Paired-end150bp，测序数据为FASTQ格式；
(3)从ftp://ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/edwards_et_al_2017/assembly/获得典型烟草品种的基因组，使用其scaffold水平作为参考基因组，选取长度≥1kb的scaffold，共371,419条，总长4.2Gb，用限制性内切酶SacI和MseI进行模拟酶切，选择片段双端分别为两个酶切位点且片段长度为200-600bp的片段，共获得片段355,695个；
(4)将步骤(2)得到的原始reads使用软件FastQCv0.11.5进行质量统计，并使用软件Trimmomatic-0.38进行过滤，过滤参数如下：a.双末端测序前端去掉前5个碱基，双末端测序后端去掉前3个碱基；b.从头开始去掉质量小于20的碱基，直到出现质量大于20的碱基为止，从结尾开始去掉质量小于20的碱基，直到出现质量大于20的碱基为止；c.如果5个相连碱基平均质量小于20，则去掉此5个碱基；d.Read最小长50bp；e.Reads平均质量大于20；
(5)进行DNA指纹图谱库的构建，包括：
(5-1)用BWA+GATK流程检测步骤(4)得到的reads的变异，包括1,219,877个indel和2,222,588个SNP；
(5-2)选择所述SNP，按照“QD<2.0||FS>60.0||MQ<40.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0||QUAL<40”对低质量的SNP进行过滤，得到978,426个高质量SNP；
(5-3)使用vcftools过滤掉等位基因频率小于0.05、群体中缺失率大于20％的SNP，得到104,788个SNP；
(5-4)计算每个SNP的多态性信息含量(PIC)值，选择PIC值大于0.35的SNP，得到65,582个SNP；
(5-5)依据参考基因组Scaffold的数量及其长度，选...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘楠，张威，何声宝，王英元，罗安娜，冯晓民，张晓慧，范月月，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南;41