一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物催化与转化技术领域，尤其涉及一种生产α,ω‑二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用。本发明专利技术设计的生物合成途径分为三个模块分别在宿主细胞中共同表达几种不同的酶，然后利用整细胞分别级联反应催化从环烷烃、环烷醇、内酯生成α,ω‑二元羧酸。与化学法相比，本工艺在生产过程中不产生任何有害气体，不需要高温高压以及复杂金属催化剂等，是绿色环保的生产途径。与现有生物酶法相比，本工艺使用整细胞反应免去细胞破碎、酶纯化等复杂过程，与现有生物发酵法相比，所用细胞为静息细胞避免了发酵法存在的由于发酵培养基和代谢产物复杂带来的后期分离困难的问题，降低了成本，开辟了α,ω‑二元羧酸的新合成途径。

【技术实现步骤摘要】
一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用
本专利技术属于生物催化与转化
，尤其涉及一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用。
技术介绍
脂肪族α,ω-二元羧酸(DCAs)是一类重要的平台化学产品，广泛应用于香水、聚合物、粘合剂、以及大环内酯类抗生素。在这一类化学品中己二酸倍受关注，己二酸(adipicacid或者adipate)又称肥酸，是一种重要的二元羧酸，它能够发生成盐反应、酯化反应、酰胺化反应等，并能与二元胺或二元醇缩聚成高分子聚合物。当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6，6)。预计到2018年，己二酸全球的市场价值将达到63亿美元，产量约为25.6亿公斤，而且还在不断增加，并且近两年新增产能主要在中国。其他的二元羧酸也都是重要的化学原料，在化学、医药、建筑、农业等方面有广泛应用。如戊二酸在塑料工业中可以作为增塑剂的中间体，在医药方面具有广谱的杀菌功能。庚二酸在工业上应用更为广泛可以用于合成润滑油、增塑剂、导热油、介电流体、表面活性剂、树脂等。辛二酸也可以用于塑料工业，制备醇酸树脂、燃料等。目前，在这些α,ω-二元羧酸中最受关注的己二酸主要以石油化工材料为原料通过化学方法合成(如以环己醇和环己酮混合物KA油为原料的硝酸氧化工艺等)。然而化学法存在生产工艺冗长、反应条件苛刻、副产物多、“三废”排放严重、产生大量温室气体等问题。因此近些年来越来越多的人着眼于通过生物转化，利用不同底物不同菌株来生产己二酸，这些过程经常需要通过代谢工程和合成生物学技术对微生物进行复杂的工程化设计。与此同时仍然存在一些问题比如：氧化还原反应的约束，代谢途径中酶的鉴定及工程化，合适宿主菌以及代谢途径的选择，以及细胞培养，发酵液后期难以纯化等潜在问题。因此，本领域急需一种绿色高效地生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，以促进二元羧酸的生物法工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用，解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，由包含催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因的重组细胞在常温常压及有氧条件下催化转化底物内酯得到α,ω-二羧酸。进一步地，底物为环烷醇时，还包括催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因的重组细胞；所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；或所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因分别构建于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。进一步地，底物为环烷烃时，还包括催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因的重组细胞；所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因与所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因，三者分别位于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化；或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因，三者中的任意两种位于同一细胞内，另外一种位于一个细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。进一步地，所述α,ω-二元羧酸包括C5、C6、C7、C8、C10、C12及C15类不同的二元羧酸。进一步地，所述催化内酯生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因包括内酯酶基因、醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和NADH氧化酶基因。所述内酯酶基因为lactonase，Rhodococcussp.HI-31，醇脱氢酶基因为ADH2，Acinetobactersp.NCIMB9871，醛脱氢酶基因为ALDH,Acinetobactersp.NCIMB9871，NADH氧化酶基因为NOX,LactobacillusbrevisDSM20054。进一步地，所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因包括醇脱氢酶基因和Baeyer-Villiger单加氧酶基因。所述醇脱氢酶为ADH1,LactobacillusbrevisATCC14869，Baeyer-Villiger单加氧酶基因为BVMO，Acinetobactersp.NCIMB9871，并且含有双突变位点C376I/M400I。进一步地，所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因包括P450BM319A12基因、P450BM3A82F基因和P450BM3A82F/A328F中的任一种，还包括葡萄糖脱氢酶基因GDH。进一步地，催化底物为环烷烃时，催化反应液中加入葡萄糖溶液。进一步地，将包含催化相应底物生成α,ω-二羧酸途径相关功能基因的细胞在TB液体培养基中培养，并加入IPTG或乳糖诱导剂诱导表达；收集培养的菌体用于底物转化。在优选的实施方式中，所述细胞是大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的任一种；最优选地，所述细胞是大肠杆菌(E.coli)。进一步地，所述催化反应在常温常压及有氧条件下进行，在具体的实施方式中，所述催化反应在20-40℃的温度范围内；优选在25-30℃的温度范围内；更优选在25℃进行。如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产α,ω-二元羧酸中的应用。如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法在生产C5、C6、C7或C8类二酸产品中的任一种中的应用。如上述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法中的重组细胞在制备固定化细胞中的应用。本专利技术以己二酸的生产为特征反应进行，使用整细胞一锅法分别以环己烷、环己醇、ε-己内酯为起始底物生产己二酸。以环己醇为底物进行反应的细胞命名为E.coli(M2E_M3J)包含模块二和模块三，在不经过任何优化的情况下50mM环己醇可以得到3mM己二酸，证明一个细胞可以实现环己醇到己二酸的转化；以环己烷为底物进行反应细胞命名为E.coli(M12A_M3J)包含模块一二三，在不经过任何优化的情况下50mM环己烷可以得到4mM己二酸，证明一个细胞可以实现从环己烷到己二酸的转化；以己内酯为底物进行反应的细胞只包含模块三，在不经过优化的情况下可以得到较高浓度的己二酸，因此我们对其进行了优化，通过分批补料，最终己二酸可以达到63g/L。...

【技术保护点】
1.一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：由包含催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因的重组细胞在常温常压及有氧条件下催化转化底物内酯得到α，ω-二羧酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：由包含催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因的重组细胞在常温常压及有氧条件下催化转化底物内酯得到α，ω-二羧酸。


2.根据权利要求1所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：底物为环烷醇时，还包括催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因与所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因分别构建于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。


3.根据权利要求2所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：底物为环烷烃时，还包括催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因的重组细胞；
所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因与所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因位于同一细胞内，利用单细胞系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因，三者分别位于不同的细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化；
或所述催化环烷烃生成环烷醇途径相关功能基因、所述催化环烷醇生成内酯途径相关功能基因和所述催化内酯生成α，ω-二羧酸途径相关功能基因，三者中的任意两种位于同一细胞内，另外一种位于一个细胞内，利用多细胞组合系统实现底物的催化与转化。


4.根据权利要求1-3任一所述的一种用于生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法，其特征在于：所述细胞为原核细胞大肠杆菌(E.coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)或低等真核细胞酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爱涛，赵晶，王斐，李倩，余小娟，彭雪盈，陈小漫，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42