一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法技术

本发明专利技术提供一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，包括：以嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、pPH13和pPH14和argR基因过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16；将质粒pET30α、pPH12、pPH13和pPH14进行诱导优化，可溶性蛋白ArgR；将过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16转入嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和Benshit/pPH16；将重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16置于发酵培养基中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS。

【技术实现步骤摘要】
一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法。
技术介绍
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)分为同聚多糖和杂聚多糖，作为食品稳定剂和增稠剂能显著增加粘度防止乳清沉淀。EPS不但有利于益生菌肠内定植，还具有增强机体免疫、抗肿瘤、抗氧化和降血脂等活性功能。嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)是一种产酸性能优良的乳酸菌,其代谢合成EPS能显著改善食品质地和风味，广泛应用于乳制品发酵。嗜热链球菌EPS主要由不同比例的半乳糖和葡萄糖组成，伴有少量乙酰半乳糖、乙酰半乳糖胺、鼠李糖和岩藻糖等单糖。嗜热链球菌EPS生物合成由基因组中大小为15-36kb的eps基因簇控制，其中epsA和epsB编码EPS合成调控蛋白，epsC和epsD决定EPS链长，epsE、epsF、epsG、epsH和epsI是功能性重复糖单元，epsJ、epsK、epsL和epsM是聚合和输出单元。功能性重复糖单元中，epsE编码半乳糖基转移酶，受epsD调控；epsF、epsG和epsI编码不同的糖基转移酶，epsH编码乙酰转移酶。革兰氏阳性菌胞内精氨酸生物合成受argCJBDFRGH基因簇控制，其中argR编码精氨酸合成代谢的主要调控蛋白ArgR；结合L-精氨酸的ArgR能和启动子区域18bp回文结构序列(ARGboxes)结合，强烈抑制操纵子上游启动子活性，负调控整个精氨酸合成通路。ArgR蛋白N端由Ser-57和Arg-58构成的“SR”序列，用于DNA结合；C端保守区域是与L-精氨酸和部分DNA结合的结构域，6个精氨酸分子结合在2个ArgR三聚体的C端结构域界面，起到协同调控因子的作用。ArgR与ARGboxes序列结合引起基因结构的拓扑形变，诱发调控作用。除调控精氨酸合成，ArgR在天蓝色链霉菌中直接或间接控制452个基因，涉及氮代谢、嘌呤和嘧啶生物合成、细胞形态和抗生素基因等众多代谢通路；在谷氨酸棒状杆菌中ArgR已证明调控谷氨酸合成代谢，而在嗜热栖热菌中还调控赖氨酸合成代谢。这些研究表明ArgR可能是一个全局性调控因子，对非精氨酸代谢也存在广泛调控，但目前尚未见对EPS合成调控的报道。嗜热链球菌Benshit是本实验室筛选的一株具有良好产粘性和口感辅助效果的益生乳酸菌。对嗜热链球菌Benshit中EPS结构解析，发现其单糖组成为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和葡萄糖，摩尔比为1:2:1，并通过全基因组测序和生物信息学分析完成eps基因簇功能注释。目前国内外对EPS生物合成的转录调控研究比较欠缺，而本专利技术首次发现ArgR对嗜热链球菌EPS合成的调控作用。
技术实现思路
本专利技术是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法。本专利技术提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Benshit获得编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR，而后采用编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR对嗜热链球菌胞外多糖含量进行进行调控，嗜热链球菌Benshit已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12098，具有这样的特征，包括：将编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的argR基因进行过表达或弱化，从而使热链球菌胞外多糖含量降低或升高，包括如下步骤：步骤1，以嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达质粒pPH14；步骤2，以嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因过表达质粒pPH15和argR基因弱化表达质粒pPH16步骤3，将质粒pET30α、argR基因外源表达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达质粒pPH14进行诱导优化，得到可溶性的含有His-tag标签的精氨酸代谢调控蛋白ArgR；步骤4，将过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16转入嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16；步骤5，分别将重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16置于种子液中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS，其中，argR基因的序列如SEQIDNo：1所示。在本专利技术提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以具有这样的特征：其中，argR基因外源表达质粒pPH12的序列如SEQIDNo：2所示，argR基因外源表达质粒pPH13的序列如SEQIDNo：3所示，argR基因外源表达质粒pPH14的序列如SEQIDNo：4所示。在本专利技术提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以具有这样的特征：其中，过表达质粒pPH15的序列如SEQIDNo：5所示，弱化表达质粒pPH16的序列如SEQIDNo：6所示。在本专利技术提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以具有这样的特征：其中，质粒pET30α的序列如SEQIDNo：7所示。在本专利技术提供的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法中，还可以具有这样的特征：其中，含有His-tag标签的精氨酸代谢调控蛋白ArgR的序列如SEQIDNo：8所示。本专利技术还提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的过表达质粒，用于降低所述嗜热链球菌胞外多糖含量，具有这样的特征：过表达质粒含有如权利要求3中的序列，该序列如SEQIDNo：5所示。本专利技术还提供了一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的过表达质粒，用于提高所述嗜热链球菌胞外多糖含量，具有这样的特征：弱化表达质粒含有如权利要求3中的序列，该序列如SEQIDNo：6所示。专利技术的作用与效果本专利技术所涉及的调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过尿素变性复性的方法纯化大肠杆菌外源表达ArgR包涵体，并将纯化蛋白和启动子结合互作以鉴定调控作用，同时通过过表达和弱化argR基因后测定胞外多糖产量的方案确定了调控蛋白ArgR对嗜热链球菌胞外多糖合成的应用基础，即利用大肠杆菌异源表达嗜热链球菌含His-tag标签的ArgR蛋白，通过尿素变性-复性和Ni2+亲和层析纯化，并利用凝胶电泳迁移(EMSA)和生物膜层干涉(BLI)证明ArgR和eps基因簇中PepsA启动子有特异性结合，并且过表达argR基因显著降低了EPS合成，而弱化argR基因则提高了EPS合成。此外，本专利技术首次发现ArgR这类蛋白能特异性结合嗜热链球菌eps基因簇启动子，调控EPS的合成。附图说明图1是本专利技术的实施例1中质粒构建示意图；图2是本专利技术的实施例2中ArgR异源表达和纯化情况图；图3是本专利技术的实施例3中同诱导条件的蛋白表达情况图；图4是本专利技术的实施例3中尿素变性纯化包涵体ArgR示意图；图5是本专利技术的实施例4中凝胶电泳迁移实验检测ArgR和PepsA的相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Benshit获得编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR，而后采用所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR对所述嗜热链球菌胞外多糖含量进行调控，所述嗜热链球菌Benshit已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12098，其特征在于，将所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的argR基因进行过表达或弱化，从而使所述热链球菌胞外多糖含量降低或升高，包括如下步骤：/n步骤1，以所述嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达质粒pPH14；/n步骤2，以所述嗜热链球菌Benshit的所述基因组为模板，构建argR基因过表达质粒pPH15和argR基因弱化表达质粒pPH16；/n步骤3，将质粒pET30α、所述argR基因外源表达质粒pPH12、所述argR基因外源表达质粒pPH13和所述argR基因外源表达质粒pPH14进行诱导优化，得到可溶性的含有His-tag标签的所述精氨酸代谢调控蛋白ArgR；/n步骤4，将所述过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16转入所述嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16；/n步骤5，分别将所述重组菌株Benshit/pPH15和所述重组菌株Benshit/pPH16置于发酵培养基中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS，/n其中，所述argR基因的序列如SEQ ID No：1所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种调控嗜热链球菌胞外多糖含量的方法，通过嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Benshit获得编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR，而后采用所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR对所述嗜热链球菌胞外多糖含量进行调控，所述嗜热链球菌Benshit已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12098，其特征在于，将所述编码精氨酸代谢调控蛋白ArgR的argR基因进行过表达或弱化，从而使所述热链球菌胞外多糖含量降低或升高，包括如下步骤：
步骤1，以所述嗜热链球菌Benshit的基因组为模板，构建argR基因外源表达质粒pPH12、argR基因外源表达质粒pPH13和argR基因外源表达质粒pPH14；
步骤2，以所述嗜热链球菌Benshit的所述基因组为模板，构建argR基因过表达质粒pPH15和argR基因弱化表达质粒pPH16；
步骤3，将质粒pET30α、所述argR基因外源表达质粒pPH12、所述argR基因外源表达质粒pPH13和所述argR基因外源表达质粒pPH14进行诱导优化，得到可溶性的含有His-tag标签的所述精氨酸代谢调控蛋白ArgR；
步骤4，将所述过表达质粒pPH15和弱化表达质粒pPH16转入所述嗜热链球菌Benshit，得到重组菌株Benshit/pPH15和重组菌株Benshit/pPH16；
步骤5，分别将所述重组菌株Benshit/pPH15和所述重组菌株Benshit/pPH16置于发酵培养基中进行过夜培养、离心发酵、透析，得到嗜热链球菌胞外多糖EPS，<...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊智强，艾连中，潘晖，刘欣欣，宋馨，夏永军，王光强，张汇，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31