一种耐硒细菌筛选方法及应用技术

本发明专利技术属于细菌筛选技术领域，公开了一种耐硒细菌筛选方法及应用，取制备的富硒土壤悬液加到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养；将振荡培养后的菌液接种到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；将培养的菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；将得到的菌液用无菌水稀释，取稀释菌液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置于生化培养箱中恒温培养；将长出的单菌落划线分离，之后置于生化培养箱中恒温培养，获得纯菌株；取长出的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，之后置于摇床中振荡培养。本发明专利技术材料成本低、实验方法简单和对环境无污染。

【技术实现步骤摘要】
一种耐硒细菌筛选方法及应用
本专利技术属于细菌筛选
，尤其涉及一种耐硒细菌筛选方法及应用。
技术介绍
目前，在高硒区自然环境中寻找超耐硒并能还原硒的微生物方法：通过对湖北省恩施市新塘乡渔塘坝硒矿床带采集的10种检样分别进行富集、分离、筛选、纯化培养出具有超耐硒能力的菌株3株，经鉴定分别为鲍氏不动杆菌、地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌。初步研究了这3株菌的培养特性、形态特征和生化学与分子生物学性状。结果地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌在含硒量为33000μg/ml的营养琼脂培养基中能正常生长并能还原无机硒为红色单质硒，在含硒量为46500μg/ml时仍能缓慢生长。结论：超耐硒微生物的发现，在治理环境硒污染、富硒农产品开发等方面具有重要意义。综上所述，现有技术存在的问题是：现有耐硒细菌的筛选方法存在操作复杂，效率低。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种耐硒细菌筛选方法及应用。本专利技术是这样实现的，一种耐硒细菌的筛选方法，所述耐硒细菌的筛选方法包括以下步骤：第一步，取制备的富硒土壤悬液加到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养；第二步，将振荡培养后的菌液接种到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；第三步，将培养的菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；第四步，将得到的菌液用无菌水稀释102-107，取稀释105、106、107菌液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置于生化培养箱中恒温培养；r>第五步，将长出的单菌落划线分离，之后置于生化培养箱中恒温培养，获得纯菌株；第六步，取长出的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，之后置于摇床中振荡培养。进一步，所述富硒土壤悬液的制备方法包括：称取10g富硒土壤样品，加入放置有10颗玻璃珠的已灭菌的去离子水的锥形瓶中，置于摇床中振荡，摇床的温度为28℃，转速为180r/min，振荡时间为30min，静置30min；所述第一步取制备的富硒土壤悬液加到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养。进一步，取制备的富硒土壤上清液，加入到放置有含浓度为100μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，液体培养基的量为50ml，置于摇床中振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h。进一步，所述第二步将振荡培养后的菌液接种到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌液的接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基总体积的5％-10％，之后置于摇床振荡培养，重复3-5次。进一步，将振荡培养后的菌液接种到有含浓度为100μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，菌液接种量体积分数为5％，液体培养基的量为50ml，置于摇床中振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h，重复4次。进一步，所述第三步将培养的菌液接种到含亚硒酸钠的量为0-20000μg/ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌液的接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基总体积的0.5％-2％，之后置于摇床振荡培养。进一步，将培养的菌液接种于放置有含亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在摇床中培养，其中液体培养基中含亚硒酸钠的量为0，2000，5000，8000，10000，12000，15000，18000，20000，22000，25000μg/ml，菌液接种量体积分数为2％，液体培养基的量为50ml，置于摇床中振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h。进一步，所述第四步取菌液用无菌水稀释102-107，取105、106、107菌液涂布于含亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置于生化培养箱中恒温培养，涂布的菌液体积为100μl，生化培养箱的温度为30℃，培养时间为72h；所述第五步用接种环挑取长出的单菌落，接种于放置有牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，接着将接种后的锥形瓶放置在摇床中培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h；所述第六步用接种环挑取长出的单菌落，结合平板划线法，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基，置于生化培养箱中恒温培养，挑取单菌落用于革兰氏染色；用接种环挑取长出的单菌落，接种于放置有牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，取1ml接种于99ml的不同pH或不同盐浓度的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为48h；所述第七步之后需要：(1)总DNA提取；(2)将纯化的细菌提取总DNA用细菌16SrDNA通用引物进行扩增，进行测序鉴定。本专利技术的另一目的在于提供一种治理环境硒污染的方法，所述治理环境硒污染的方法使用所述耐硒细菌的筛选方法。本专利技术的另一目的在于提供一种富硒农产品开发的方法，所述富硒农产品开发的方法使用所述耐硒细菌的筛选方法。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术的耐硒细菌的筛选方法的材料成本低、实验方法简单和对环境无污染。本专利技术的耐硒细菌的筛选方法在硒的生物转化、纳米硒的生物合成、硒污染环境修复中具有潜在的应用价值。附图说明图1是本专利技术实施例提供的耐硒细菌的筛选方法流程图。图2是本专利技术实施提供的耐硒菌株生长曲线。图3是本专利技术实施提供的不同pH的液体培养基对耐硒菌株生长的影响。图4是本专利技术实施提供的不同盐浓度的液体培养基对耐硒菌株生长的影响。图5是本专利技术实施提供的耐硒菌株在不同亚硒酸纳浓度的菌落数。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种耐硒细菌的筛选方法及应用，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的耐硒细菌的筛选方法包括以下步骤：S101：制备富硒土壤悬液；S102：富集培养：取制备的富硒土壤悬液加到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养；S103：继代培养：将振荡培养后的菌液接种到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌液的接种量为该牛肉膏蛋白胨液体培养基总体积的5％-10％，之后置于摇床振荡培养，如此重复3-5次；S104：梯度胁迫培养：将培养的菌液接种到含亚硒酸钠的量为0-20000μg/ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌液的接种量为该牛肉膏蛋白胨液体培养基总体积的0.5％-2％，之后置于摇床振荡培养；S105：稀释涂布平板：将得到的菌液用无菌水稀释102-107，取稀释105、106、107菌液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，所述耐硒细菌的筛选方法包括以下步骤：/n第一步，取制备的富硒土壤悬液加到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养；/n第二步，将振荡培养后的菌液接种到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；/n第三步，将培养的菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；/n第四步，将得到的菌液用无菌水稀释，取稀释菌液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置于生化培养箱中恒温培养；/n第五步，将长出的单菌落划线分离，之后置于生化培养箱中恒温培养，获得纯菌株；/n第六步，取长出的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，之后置于摇床中振荡培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，所述耐硒细菌的筛选方法包括以下步骤：
第一步，取制备的富硒土壤悬液加到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养；
第二步，将振荡培养后的菌液接种到亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；
第三步，将培养的菌液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于摇床振荡培养；
第四步，将得到的菌液用无菌水稀释，取稀释菌液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，置于生化培养箱中恒温培养；
第五步，将长出的单菌落划线分离，之后置于生化培养箱中恒温培养，获得纯菌株；
第六步，取长出的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，之后置于摇床中振荡培养。


2.如权利要求1所述的耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，所述富硒土壤悬液的制备方法包括：称取10g富硒土壤样品，加入放置有10颗玻璃珠的已灭菌的去离子水的锥形瓶中，置于摇床中振荡，摇床的温度为28℃，转速为180r/min，振荡时间为30min，静置30min；
所述第一步取制备的富硒土壤悬液加到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并置于摇床上振荡培养。


3.如权利要求2所述的耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，取制备的富硒土壤上清液，加入到放置有含浓度为100μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，液体培养基的量为50ml，置于摇床中振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h。


4.如权利要求1所述的耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，所述第二步将振荡培养后的菌液接种到含浓度为100-200μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，菌液的接种量为牛肉膏蛋白胨液体培养基总体积的5％-10％，之后置于摇床振荡培养，重复3-5次。


5.如权利要求4所述的耐硒细菌的筛选方法，其特征在于，将振荡培养后的菌液接种到有含浓度为100μg/ml亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，菌液接种量体积分数为5％，液体培养基的量为50ml，置于摇床中振荡培养，摇床温度为30℃，转速为180r/min，培养时间为18h，重复4次。


6.如权利要求1所述的耐硒细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李圣会，蒋代华，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45